极性非质子溶剂中酸强度对纤维素降解制备脱水糖的影响

曹 祁，叶 天，李文惠，武红丽，曹 飞，韦 萍

（南京工业大学 生物与制药工程学院，江苏 南京211800）

生物质在有机溶剂中经酸催化降解，特别是在 极性非质子溶剂中降解，具有降解速率快和降解产物价值高的特征［1－4］。这是因为极性非质子溶剂自身接受氢质子的倾向较弱，游离了酸电离出的氢质子，强化了催化效果以及无水环境抑制水解反应的发生，表现出与水中降解不同的产物分布［5－7］。特别是酸的氢质子电离强度变化对极性非质子溶剂中生物质转化效率会产生明显影响。Mellmer等［8］以木糖脱水制备糠醛为模型，研究不同强度酸在水和γ-戊内酯中对反应速率的影响时发现，无论何种强度的酸催化剂在γ-戊内酯中的催化活性均高于水中的，而且pKa越小则二者差别越明显。这主要是由于在γ-戊内酯中，减少了水分子对酸电离出的氢质子的溶剂化作用，使得游离氢质子浓度提高，从而增强了其反应活性。Walker等［6］以左旋葡聚糖、纤维二糖等在极性非质子溶剂（γ-戊内酯、1，4-二氧六环和四氢呋喃）中酸催化转化的反应速率来判断水含量对酸催化剂活性的影响，结果发现，随着溶剂中水含量的降低，催化脱水反应的效率可显著提高。

与水相中纤维素水解制备葡萄糖不同，纤维素在极性非质子溶剂中的降解往往形成脱水糖，包括左旋葡聚糖（1，6-脱水-β-D-吡喃葡萄糖，LGA）和左旋葡糖酮（1，6-脱水-3，4-二脱氧-β-D -吡喃糖烯-2-酮，LGO）在内的一系列脱水产物。这些脱水糖，不仅可以作为新的糖源用于微生物发酵［9－10］，也可利用其自身的手性中心来合成稀有糖、手性配体和手性药物中间体［11－13］。在极性非质子溶剂中纤维素降解制备脱水糖的产物分布上，酸催化剂也起到了重要作用［14－15］。He等［16］计算了不同的质子酸催化剂对纤维素降解获得LGO和5-羟甲基糠醛（HMF）的比率，结果发现，LGO／HMF的比率随着酸催化剂强度的增加而增加。但除此之外，文献中涉及酸强度对生物质在极性非质子溶剂中降解影响的研究非常少。

在纤维素制备脱水糖LGA、LGO的过程中，通常可以分为两个阶段：一是纤维素降解形成LGA，二是LGA再脱水形成LGO（图1中路径①和③）。这两步反应往往同时发生，无法准确判断不同反应所需的酸强度。为了阐明酸强度对纤维素降解制备脱水糖LGA、LGO的影响，考察11种不同强度的酸催化剂，包括：三氟甲磺酸（pKa＝－14）、氢溴酸（pKa＝－9）、浓盐酸（pKa＝－8）、对甲苯磺酸（pKa＝－2.8）、甲磺酸（pKa＝－2.6）、浓硫酸（pKa＝－2）、三氟乙酸（pKa＝0.23）、乙二胺四乙酸（pKa＝0.9）、马来酸（pKa＝1.92）、磷酸（pKa＝2.12）、富马酸（pKa＝3.02）的性能。以纤维素（图1中路径①）或纤维素模型化合物-纤维二糖（图1中路径②）为原料来考察在不同强度酸催化降解制备LGA的催化效率；同时以LGA为原料考察不同强度酸催化脱水获得LGO（图1中路径③）的效率以及LGA水解副反应生成葡萄糖（图1中路径④）对脱水反应的影响，为其他生物质在极性非质子溶剂中酸催化降解反应提供借鉴。

图1 纤维素或纤维二糖降解制备脱水糖及LGA水解副反应Fig.1 Degradation of cellulose or cellobiose into LGA and LGO，LGA hydrolysis side reaction

1 材料与方法

1.1 实验试剂

微晶纤维素（Avicel©PH -101，粒径～50 μm）、1，4-二氧六环（无水级，含量≥99.5%），西格玛奥德里奇公司；左旋葡聚糖和左旋葡糖酮，苏州卡博森斯化学科技有限公司；纤维二糖（98%）和各种酸催化剂，阿拉丁试剂（上海）有限公司。

1.2 实验仪器

E100型EasyChem高温高压反应釜，北京世纪森朗公司；SQP型电子分析天平，德国赛多利斯公司；LC -20AD型高效液相色谱仪、GC -2014型气相色谱仪，日本岛津公司。

1.3 实验方法

将反应物、1，4二氧六环以及酸催化剂依次加入反应釜中。取样管用孔径75 μm钢丝筛网包裹，以防止反应液中的固体颗粒进入取样管路。密闭反应釜用N2置换3次后，通入N2加压至7 MPa。开启搅拌，升温至设定条件定为初始时刻t0，分别在不同时间取样。为减少取样时样品溶剂气化造成的检测误差，取样管要提前放置于冰浴中冷却。反应结束后冷却至室温，排气后取出反应液。

1.4 产物的检测方法

对反应过程中的主要产物左旋葡聚糖、左旋葡糖酮以及副产物葡萄糖分别采用气相色谱和液相色谱进行检测。

气相色谱分析方法。色谱柱为Restek Rtx-VMS caplillary（30 m×0.25 mm，1.4 μm），检测器为氢火焰离子化（FID）检测器，载气为高纯He（分流比为49∶1），进样口温度为240℃，检测器温度为240℃（升温程序初始温度40℃保持5 min，以升温速率7.5℃／min升至240℃，保持15 min），柱流速为3.0 mL／min，尾吹气流速为30 mL／min，H2流速为40 mL／min，空气流速为400 mL／min，进样量为1 μL。

高效液相色谱分析方法。色谱柱为Bio -Rad Aminex HPX -87H（300 mm×7.8 mm），检测器为示差折光检测器和紫外检测器，流动相为5 mmol／L稀H2SO4水溶液；流速为0.6 mL／min，柱温为35℃，检测器温度为35℃，进样量为10 μL。

1.5 计算方法

1.5.1 产物收率的计算。

产物收率的具体计算见式（1）。

式中：i为产物左旋葡聚糖、左旋葡糖酮以及副产物葡萄糖。

1.5.2 转化频率的计算

催化剂的转化频率（TOF）是指单位时间内单个活性位点的反应物转化数，它可以用来衡量一个催化剂的本征活性。当纤维二糖和LGA转化率低于10%时，使用纤维二糖和LGA随时间变化的浓度计算TOF，具体计算见式（2）。

式中：TOF为酸催化剂对纤维二糖或LGA的转化频率（ks－1）；c为反应物的浓度（mol／L）；t为反应时间（ks）。

1.5.3 反应过程中活化能的计算

活化能代表反应物的分子由初始稳定状态转变为活化状态所吸收的能量，是重要的热力学参数。LGA脱水和水解的反应活化能由阿伦尼乌斯公式计算［17］，具体计算见式（3）。

式中：Ea为反应所需的活化能（kJ／mol）；k是反应速率常数（s－1）；A是指前因子；R是摩尔气体常数（8.314 J／（mol·K））；T是热力学温度（K）。

假设由LGA脱水形成LGO和水解形成葡萄糖的过程都是一级反应过程，则有

式中：v为产物的生成速率（g／（L·s））；ρ为反应物质量浓度（g／L）。

式（3）可变为

因此，由实验测出不同反应温度下的速率常数k值后，将lnk对1/T作图，由斜率可求出相应活化能Ea。

2 结果与讨论

2.1 酸强度对纤维二糖制备LGA的影响

纤维二糖是纤维素基本结构单元，常用作纤维素的最简单模型化合物。通过考察不同强度酸催化纤维二糖制备LGA（图1中路径②）的反应结果，可以初步筛选纤维素制备LGA最佳催化剂酸强度。1，4-二氧六环加入量为100 mL，纤维二糖用量为溶剂质量的1%，各种酸催化剂的用量均以15 mmol／L H＋为标准来加入，反应温度190℃，反应釜搅拌转速600 r／min。在11种酸催化剂中，未使用浓盐酸和富马酸验证，原因是：浓盐酸（pKa＝－8）挥发严重，在高温反应体系中挥发会更剧烈，同时，引入了大量水不利于催化反应；而富马酸（pKa＝3.02）酸性最弱且不能溶解在溶剂中，无法达到试验的目的。不同酸催化剂pKa与LGA碳收率的结果见图2。

图2 酸强度和纤维二糖生成LGA碳收率的相关性Fig.2 Correlation between the acid strength and LGA carbon yield prepared from cellobiose

由图2可知，pKa为－3～－2的酸：对甲苯磺酸（pKa＝－2.8）、甲磺酸（pKa＝－2.6）和浓硫酸（pKa＝－2）作催化剂可获得较好的效果，LGA的碳收率分别为45.72%、45.87%和45.17%。而当三氟甲磺酸（pKa＝－14）和氢溴酸（pKa＝－9）作催化剂时，并没有获得更高的LGA碳收率（分别为31.13%和10.97%）。当酸催化剂的pKa＞－2时，催化纤维二糖几乎无法获得LGA。其中，三氟乙酸（pKa＝0.23）、草酸（pKa＝1.27）为催化剂时无法检测到LGA，以磷酸（pKa＝2.12）为催化剂时，仅得到碳收率为1.23%的LGA。

根据式（2）计算不同强度酸催化纤维二糖制备LGA的转化频率（TOF），考察酸强度与转化频率的相关性，结果如图3所示。由图3可知：转化频率TOF与酸强度pKa呈线性相关，即催化剂的酸性越强，其TOF值越大，该催化剂催化纤维二糖转化为LGA的速率越快。酸性最强的三氟甲磺酸的TOF值最大，达到85.33 ks－1；而pKa为－3～－2的对甲苯磺酸、甲磺酸和浓硫酸的TOF值接近，分别为24.37、23.04和20.67 ks－1；当酸催化剂的pKa＞－2时，其TOF值均很低，最低仅为0.68 ks－1。

结合图2和图3结果分析可以发现：虽然pKa是不同酸在水体系中H＋的解离常数值，但也适用于不同酸在有机溶剂体系中H＋解离度的判断。酸催化剂的pKa越小，其在极性非质子溶剂种电离出的H＋越多，催化纤维二糖转化为LGA的转化频率越大；反之，pKa越大，其电离出的H＋越少，则无法催化糖苷键断键，纤维二糖转化为LGA的转化频率越小，甚至无LGA形成。这与Mellmer等［8］研究γ-戊内酯溶剂中酸催化木糖脱水反应得到的结果一致。但pKa过小的酸催化剂，转化频率虽高，却会造成脱水反应过度而发生碳化现象，目标产物LGA的收率反而下降。为了获得良好的纤维二糖制备LGA收率，选择pKa为－3～－2的对甲苯磺酸、甲磺酸和浓硫酸作为催化剂比较合适。

图3 酸强度与纤维二糖脱水制备TOF值的相关性Fig.3 Correlation between the acid strength and TOF value of cellobiose degradation into LGA

2.2 酸强度对纤维素LGA的影响

在纤维二糖酸催化制备LGA的基础上，进一步考察不同强度酸催化剂催化纤维素制备脱水糖LGA（图1中的反应路径①）的反应。反应条件与前述相同。在这里未选用磷酸，是因为其pKa为2.12，与pKa为1.92的马来酸酸性强弱相近。不同酸催化剂pKa与LGA碳收率的结果见图4。

图4 酸强度和纤维素生成LGA碳收率的相关性Fig.4 Correlation between the acid strength and LGA carbon yield prepared from cellulose

由图4可知：采用纤维素为反应物时，不同强度酸催化获得的LGA收率与纤维二糖作反应物时相似，pKa为－3～－2的酸催化可获得较好的LGA收率。其中，对甲苯磺酸（pKa＝－2.8）、甲 磺 酸（pKa＝－2.6）和浓硫酸（pKa＝－2）为催化剂时，LGA的碳收率分别为36.01%、33.56%和36.28%。三氟甲磺酸、氢溴酸和浓盐酸为催化剂时，纤维素的碳化程度非常严重，所得LGA的碳收率为15%～20%；pKa大于－2的酸为催化剂时，几乎无LGA生成。因此，在纤维二糖中考察的酸强度结果也适用于纤维素降解过程，pKa为－3～－2的酸催化剂对纤维素制备脱水糖有良好的催化作用。

2.3 酸强度对LGA脱水制备LGO的影响

与酸催化纤维素或纤维二糖形成LGA不同，LGA进一步形成LGO需要脱除2分子水，所需的酸强度会更大。以1 g LGA为反应物，在100 mL 1，4-二氧六环、190℃条件下，各种酸催化剂的用量标准为15 mmol／L H＋，考察不同强度酸催化剂催化LGA制备脱水糖LGO（图1中的反应路径③）的影响。选择了在2.1和2.2节中具有典型催化特性的8种酸催化剂，不同酸催化剂pKa与LGO、葡萄糖的碳收率结果见图5。

图5 不同强度酸催化LGA生成LGO和葡萄糖的碳收率Fig.5 Carbon yield of LGO and glucose from LGA with different acid catalysts

由图5可知：对甲苯磺酸（pKa＝－2.8）、甲磺酸（pKa＝－2.6）和浓硫酸（pKa＝－2）为催化剂时，LGO的碳收率分别为34.41%、32.49%和36.91%，LGO碳收率与葡萄糖碳收率比值分别为5.1、4.1和5.5；而 当 三 氟 甲 磺 酸（pKa＝－14）和 氢 溴 酸（pKa＝－9）为 催 化 剂 时，LGO的 碳 收 率 分 别 为20.65%和16.01%的，LGO与葡萄糖碳收率的比值降至1.3；当催化剂酸性减弱时，LGO的收率反而低于葡萄糖的收率，两者收率比值降至0.48，甚至三氟乙酸（pKa＝0.23）为催化剂时，仅有葡萄糖生成。这表明在脱水反应过程中，催化剂酸强度的选择极大地影响LGO的生成。pKa为－3～－2的酸催化剂均有较好的催化效果，而酸性过强和过弱对LGO的生成均无良好的催化效果。同时，在LGA脱水生成LGO时，总会伴有LGA水解产物葡萄糖的生成。

根据式（2）计算不同酸催化LGA脱水反应的转化频率，考察酸强度与LGA到LGO转化频率的相关性，结果见图6。由图6可知：LGA到LGO转化频率（TOF）随酸强度的增大而减小。pKa最小的三氟甲磺酸的TOF值也最大（24.57 ks－1），以至于其催化LGA脱水时，LGA的转化频率过快，反应进程甚至难以监测；而pKa为－3～－2的对甲苯磺酸、甲磺酸和浓硫酸的TOF值相近，均在5 ks－1左右；pKa＞－2时，TOF值均很低，磷酸（pKa＝2.12）的TOF值最低（0.06 ks－1），无法催化LGA脱水制备LGO。

图6 酸强度和LGA脱水制备LGO转化频率的相关性Fig.6 Correlation between the acid strength and the TOF value of LGA dehydration into LGO

2.4 LGA水解至葡萄糖和脱水至LGO两条途径的动力学

在LGA脱水制备LGO的过程中，总会伴随产生部分葡萄糖，这主要来自于LGA的水解。在考察不同酸催化LGA脱水制备LGO的过程中，发现葡萄糖的生成量也与酸强度存在一定的关系。因此，选择催化效果较好的3种催化剂与水解产生葡萄糖相对较多的三氟甲磺酸催化剂进行比较。在100 mL 1，4-二氧六环中，4种酸催化剂的用量仍为15 mmol／L H＋，在反应过程中定时取样测定LGO和葡萄糖浓度随时间变化，分别计算LGA脱水和水解两条途径（图1中的反应路径③和④）的反应速率常数和活化能，其结果见表1。

由表1可知：无论是水解途径还是脱水途径，随着温度升高，其反应速率常数均提高；在使用酸性最强的三氟甲磺酸为催化剂时，即使在110、130和150℃这3个低温反应条件下，脱水反应和水解反应的速率常数k都比另外3种酸为催化剂在150、170和190℃高温条件下的速率常数k大。由此可见，酸性增强会大大加快反应速率。同时，脱水反应和水解反应的活化能均随酸性增强而降低，且无论以何种酸为催化剂，LGA水解形成葡萄糖的反应活化能均低于其脱水成为LGO的反应活化能。三氟甲磺酸为催化剂时，LGA水解生成葡萄糖的活化能为19.5 kJ／mol，而脱水反应活化能为68.2 kJ／mol，脱水反应与水解反应活化能的比值为3.50。其他3种酸的水解反应活化能和脱水反应活化能均高于三氟甲磺酸，二者活化能的比值根据pKa由小到大分别为2.71、1.74和1.25。这表明LGA水解途径比脱水途径更易进行，水解反应是LGA脱水制备LGO过程中最大的副反应，这也是造成纤维素制备脱水糖产物收率低的一个重要原因。而调节催化剂酸强度，可以改变水解反应活化能和脱水反应活化能的差距，是提升LGA脱水制备LGO收率的重要手段。

表1 LGA脱水和水解两条反应途径反应速率常数和活化能Table 1 Kinetics constant and activation energy of LGA dehydration and hydrolysis

3 结论

在极性非质子溶剂中，催化剂酸强度对于纤维素降解制备脱水糖具有显著影响。选择了11种具有不同pKa的酸催化剂，考察纤维素、纤维二糖降解制备LGA和LGA脱水制备LGO的碳收率、TOF与酸强度的相关性。结果表明，pKa为－3～－2的酸催化剂（如对甲苯磺酸、甲磺酸、浓硫酸），无论对于纤维素降解还是LGA脱水均具有良好的催化效果。酸性过强或过弱均对脱水糖制备不利，这为极性非质子溶剂中纤维素降解制备脱水糖反应提供了一个催化剂酸强度范围选择的重要参考值。同时，通过对LGA水解至葡萄糖和脱水至LGO的两条途径的动力学考察发现，LGO的水解是制备脱水糖过程中最大的副反应，而通过调节催化剂酸强度，可以改变水解反应活化能和脱水反应活化能的差距，是提升LGA脱水制备LGO收率的重要手段。