改性生物填料载体强化厌氧氨氧化反应器脱氮研究

黄嘉豪，刘桂文，朱 杰，陈 勇

（1.南京工业大学 生物与制药工程学院 国家生化工程技术研究中心，江苏 南京211800；2.南京高新工大生物技术研究院有限公司，江苏 南京210032）

厌氧氨氧化是指厌氧氨氧化菌在无机厌氧条件下，以亚硝基氮（－N）作为电子受体，以氨氮（－N）作为电子供体，生成N2和少量硝基氮（－N）的 过 程［1］。与 传 统 的 生 物 脱 氮 工 艺（硝化 反硝化工艺）相比，厌氧氨氧化工艺更适合处理现阶段普遍存在的高氨氮和低碳氮比废水，具有运行成本低、脱氮效率高、不造成二次污染等优点［2］，因此，该工艺日益受到广大研究者的青睐并加以开发应用［3－4］。然而，厌氧氨氧化菌自身倍增时间较长（约11～14 d），其生长及代谢状况极易受到外界环境的影响，从而使得厌氧氨氧化工艺无法在实际应用中得到进一步推广。

微生物固定化技术能够在保持微生物生物活性的同时提高微生物对外界环境不利因素的抗逆性能［5］，该技术在厌氧氨氧化工艺中已经得到一定程度的应用［6－10］。不同生物填料载体的材质及亲／疏水性往往具有差异，这使得其表面形成生物膜的性能可能不同，对反应器性能的影响也具有差异［11－12］。针对微生物的生理特征，对普通的生物填料载体进行改性有利于进一步提高反应器的性能。至目前为止，研究者主要集中考察普通生物填料载体对厌氧氨氧化反应器脱氮性能的影响，而有关改性生物填料载体对厌氧氨氧化反应器脱氮性能的影响报道较少，考察改性生物填料载体对厌氧氨氧化反应器脱氮性能的影响在一定程度上能使微生物固定化技术在厌氧氨氧化工艺中得到进一步推广。

本研究以3个上流式厌氧污泥床（up-flow anaerobic sludge bed，UASB）反应器作为研究对象，其中2个UASB反应器内分别填充改性活性炭聚氨酯及改性聚乙烯塑料填料2种不同的生物填料载体，剩余的反应器则不添加任何生物填料载体；通过提高进水（influent，Inf）基质浓度或缩短水力停留时间（hydraulic retention time，HRT）的方式来提高反应器的容积负荷（nitrogenloading rate，NLR）。通过比较3个反应器脱氮性能的变化，对比分析改性生物填料载体对厌氧氨氧化反应器脱氮性能的影响。同时，从微观方面阐述影响差异的原因，以期为改性生物填料载体在厌氧氨氧化工艺中的应用推广提供一定的理论基础。

1 材料及方法

1.1 试验装置

试验采用3个结构和尺寸完全相同的UASB反应器作为厌氧氨氧化反应器，反应器的结构如图1所示，并命名为R1、R2及R0。其中R1为填充了活性炭聚氨酯的反应器；R2为填充了改性聚乙烯塑料填料的反应器；R0作为对照组，不投加任何改性生物填料载体。3个UASB反应器由有机玻璃制成，有效容积为1.8 L。反应器外带有水浴夹套，由恒温槽控制反应器内温度。同时，为了防止光源对厌氧氨氧化菌的活性产生影响，采用黑色海绵对反应器进行遮光处理。实验室模拟废水由BT-100蠕动泵从底部进入反应器，从沉淀区上部流出，整个反应系统连续运行。

图1 反应器结构示意Fig.1 System of up-flow anaerobic sludge bed reactor

1.2 生物填料

选取笔者所在实验室改性的2种生物填料载体作为厌氧氨氧化菌的挂膜载体，分别为活性炭聚氨酯和改性聚乙烯塑料填料。这2种生物填料均具有比表面积大、强度高、不堵塞、易挂膜并且价廉易得的优点。2种改性生物填料载体的性质如表1所示。向R1中投入活性炭聚氨酯，向R2中投入改性聚乙烯塑料填料，填充率均为70%。

表1 2种生物填料载体的性质Table 1 Properties of two biofilm carrier

1.3 运行条件

在实验进行前，向3个厌氧氨氧化反应器接入等量的厌氧氨氧化污泥，接种量为10%。实验开始时，调节进水的浓度和质量浓度约为100 mg／L，然后通过分阶段逐步提高进水的和浓度或缩短水力停留时间的方式来提高3个反应器的容积负荷，并分析2种改性生物填料载体对厌氧氨氧化反应器脱氮性能的影响。在试验结束时，取出R1、R2及R0反应器的底泥及R1、R2内的改性生物填料载体，对其进行脱氢酶活性检测，并对微生物菌群结构进行高通量测序。同时，使用扫描电子显微镜（SEM）对2种改性生物填料表面生物膜进行观察，从微观的角度解释影响差异的原因。在整个试验的过程中，控制反应器的运行温度为35℃，进水pH约为8.0，其他反应器运行条件如表2所示。

表2 实验运行条件Table 2 Strategy of experimental operation___________________________________

1.4 实验废水

实验采用人工配制的模拟废水，其主要成分如表3所示。

表3 模拟废水组成成分Table 3 Components of synthetic wastewater

1.5 分析项目及其方法

1.5.1 进出水水质分析

进出水水质测定所用的分析方法均参照文献［13］所记载的方法，分别测定、和总氮等水质参数，并根据各氮素基质在反应器进水和反应器出水（effluent，Eff）的质量浓度差来计算各氮素基质的去除率及反应器的容积去除率（nitrogen removal efficiency，NRE）等实验指标，具体计算见式（1）～（5）。

1.5.2 SEM分析

实验结束后，从R1、R2这2个反应器内取出若干个生物填料载体，首先使用适量2.5%、pH7.2的戊二醛溶液浸泡，并于4℃冰箱内固定过夜；然后使用0.1 mol／L、pH7.2的磷酸盐缓冲液清洗3次以去除生物填料表面残余的戊二醛；其次使用不同浓度的乙醇溶液对生物填料载体进行脱水处理，并用乙酸异戊酯进行置换；再次将置换后的生物填料载体置于真空冷冻干燥机中进行干燥；最后在生物填料载体表面镀上1 500 nm厚度的金属膜，使用SEM进行观察。

1.5.3 脱氢酶活性检测

在细胞呼吸过程中，作为氢受体的2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）在脱氢酶作用下接受氢以后，便被还原为显色为红色的三苯基甲（TF）［14］，其在485 nm波长下具有吸光值，根据吸光值可以计算出TF的生成量，从而算出脱氢酶（TTC-DHA）的活性。测定步骤如下：

①于厌氧氨氧化反应器的污泥床中取适量的菌泥，置于37℃烘箱中烘干（生物填料载体表面微生物的提取则是于反应器中取5～10个生物填料载体，使用磷酸盐缓冲液进行浸泡，然后将其置于适当频率的超声波下进行提取，再将提取液置于37℃烘箱中烘干）。

②将样品过270～550 μm筛，然后根据土壤脱氢酶检测盒（苏州科铭生物技术有限公司）说明书对2个反应器的底泥及生物填料载体表面微生物的脱氢酶活性进行检测。

1.5.4 微生物菌群结构分析

实验结束后，从3个反应器中取出若干个生物填料载体及反应器底泥；使用干冰进行保存后，将样品送至广州基迪奥生物科技有限公司进行高通量测序，以分析2种生物填料载体表面微生物菌群组成差异。

2 结果与讨论

2.1 不同改性生物填料载体对厌氧氨氧化反应器脱氮性能的影响

添加生物填料载体后，反应器性能的变化能够最直观地反映生物填料载体投加的作用，因此通过比较3个厌氧氨氧化反应器在不同容积负荷条件下的脱氮性能，可以分析出不同改性生物填料载体对厌氧氨氧化反应器脱氮性能的影响。

不同容积负荷条件下，3个厌氧氨氧化反应器脱氮性能的变化情况如图2和图3所示。

图2 不同厌氧氨氧化反应器进出水氮素及其去除率变化情况Fig.2 Changes of nitrogen concentration and removal rate in different anammox reactors

图3 不同厌氧氨氧化反应器容积负荷、容积去除量及去除效率变化情况Fig.3 Changes of NLR，NRR and NRE in different anammox reactors

为进一步探究2种改性生物填料载体对厌氧氨氧化反应器脱氮性能的影响，在第16天通过缩短反应器的水力停留时间来提高反应器的容积负荷。从图2可以看出：此阶段R0、R1、R2的去除率及其去除率均有所下降，3个反应器的去除率依次下降至76.81%、77.12%和87.00%；而亚硝酸盐去除率则依次降低至76.85%、78.55%和79.88%；同时，3个反应器的脱氮效率也有所下降，在第20天时R0、R1、R2的脱氮效率依次为71.31%、71.62%和72.76%；这可能是由于在进水基质刚提高不久后直接缩短了反应器的水力停留时间，部分进水及未来得及被厌氧氨氧化菌代谢而直接被排放出反应器，从而导致反应器出水基质浓度变高，反应器脱氮性能有所下降［15］。

2.2 2种改性生物填料载体表面生物膜SEM分析

实验结束后，从R1和R22个反应器中取出若干个改性生物填料载体，对其进行扫描电镜观察，结果见图4。从图4可以看出：2种改性生物填料载体表面布满大量的球状菌，它们之间紧密排列，并呈现厌氧氨氧化富集物的典型结构——“花椰菜”结构［24］。该挂膜效果仅仅使用了40 d，这说明本实验室改性的活性炭聚氨酯及聚乙烯塑料填料对厌氧氨氧化菌具有较好的吸附性能，高梦佳等［25］发现塑料填料载体挂膜需要105 d，并且塑料填料表面生物膜的厌氧氨氧化活性明显低于海绵载体，造成结果差异性的原因主要是因为所用的填料的电荷性能、亲疏水性及粗糙程度等影响填料性能的重要参数［26］已经过优化设计，加强了改性生物填料载体对厌氧氨氧化菌的富集效果。一般而言，生物填料载体粗糙程度越大，亲水性越强，越有利于微生物在生物填料载体表面形成生物膜［27］。高大文等［28］发现普通的聚氨酯泡沫海绵由于其表面光滑、比表面积较小且粗糙程度较低，该性质并不利于微生物在其表面附着生长；高梦佳等［25］发现普通的塑料填料并不利于厌氧氨氧化菌的挂膜，在其实验进行到第60天仍无法在普通塑料填料表面检测到厌氧氨氧化活性。改性后的活性炭聚氨酯及聚乙烯塑料填料在一定程度上有利于厌氧氨氧化菌的吸附，分析其原因可能是：①向普通的聚氨酯泡沫海绵表面加入生物活性炭［29］，生物活性炭对微生物较强的吸附作用能够有利于微生物在聚氨酯泡沫海绵表面形成生物膜［30］；②对聚乙烯塑料填料进行改性，增加其粗糙程度及亲水性，从而加速微生物在聚乙烯塑料填料表面的挂膜过程。

图4 2种改性生物填料载体上生物膜的扫描电子显微镜图Fig.4 SEM images of biofilms on two modified biological filler carriers

由图4可见：在2种改性填料表面除了观察到球形菌外，还明显可以观察到丝状菌的存在，与Berg等［31］在厌氧氨氧化颗粒污泥及厌氧氨氧化生物膜表面观察到厌氧氨氧化菌及丝状菌共存在的现象一致。丝状菌对于惰性载体有很强的吸附作用，其存在有利于微生物的聚集，从而增加生物填料载体上的生物量。

2.3 脱氢酶（DHA）活性检测结果

厌氧氨氧化菌将N2H4氧化为N2的过程中，将形成4个电子，该4个电子会在厌氧氨氧化菌内形成质子梯度来促使菌体自身合成ATP［32－33］，而这种磷酸化水平在厌氧微生物体内能够通过脱氢酶的活性来进行表征［34］。张正哲［35］研究发现：在反应器运行的整个过程中，厌氧氨氧化菌的活性（SAA）、heme C含量、TTC -DHA（脱氢酶活性）三者之间具有明显的正相关关系，而厌氧氨氧化菌的活性与反应器的脱氮性能在一定程度上也呈正相关关系，因此可以通过脱氢酶（DHA）活性来表征厌氧氨氧化反应菌的活性及反应器的脱氮性能。

3个UASB反应器的底泥及2种改性生物填料表面微生物的脱氢酶（DHA）活性如图5所示。由图5可以发现：R1和R22个反应器底泥的脱氢酶活性均高于对照组，说明改性生物填料载体的投加能够提高反应器内厌氧氨氧化菌的活性，这可能是由于改性生物填料的添加，部分微生物在生物填料表面形成生物膜而得以保留在反应器内，反应器内微生物之间的交流得到进一步加强，从而增强了厌氧氨氧化菌的活性。

图5 3个厌氧氨氧化反应器底泥及改性生物填料表面生物膜脱氢酶活性比较Fig.5 Comparison of dehydrogenase activity on sludge and biofilm in three anammox reactor

2种改性生物填料生物膜所含微生物的脱氢酶活性大小也有所差异，改性聚乙烯塑料填料表面生物膜的脱氢酶活性高于活性炭聚氨酯的。DHA的活性不仅与功能微生物自身的活性有关，与所测样品功能菌群丰度及菌群构成也具有一定的关系。聚烯烃类均为生物惰性材料，其生物相容性较差且对微生物的活性不具有促进作用。所用的改性生物填料的表面粗糙程度被改变并引入其他物质增加载体的亲水性，加速厌氧氨氧化菌等功能微生物在其表面形成生物膜的同时促进其表面微生物的活性，这与郭志涛等［36］的研究结果相似。郭志涛等［36］与海景等［27］发现改性后的聚烯烃类载体与未改性前相比，载体表面所形成的生物膜量明显增加，反应器对污染物的去除能力也得到进一步增强。然而，活性炭的引入虽然加强聚氨酯填料对微生物的吸附，但是在聚氨酯表面形成的生物膜一般较厚、容易老化、脱落，使得载体表面所吸附的功能微生物数量部分丧失，并且生物膜活性往往较低。以上差异均可导致改性聚乙烯塑料填料表面生物膜脱氢酶活性高于活性炭聚氨酯。

2.4 反应器底泥及改性载体表面微生物在属水平上的菌群分析

厌氧氨氧化反应器的脱氮性能不仅与反应器内微生物的生物活性有关，微生物的菌群结构及功能菌群的丰度对反应器的脱氮性能也影响甚远。改性生物填料载体的投加能够对反应器内部分微生物进行富集，增加其在反应器内的丰度，进而使得反应器内的性能发生变化。因此，通过对底泥及改性生物填料载体表面微生物进行高通量测序，能够在微观角度解析改性生物填料载体的投加对反应器脱氮性能造成影响的原因；同时通过比较改性填料载体表面功能菌群的丰度，可进一步比较改性生物填料载体的性能优劣。

以3个厌氧氨氧化反应器底泥及2种改性生物填料载体表面生物膜微生物在属水平上的含量为纵坐标、物种名称为横坐标作图，结果如图6所示。已知厌氧氨氧化菌可大致分为5种，分别为Candidatus kuenenia［37］、C.anammoxoglobus［38］、C.jettenia［39］、C.scalindua［40－41］及C.brocadia［42－43］，其中C.jettenia及C.anammoxoglobus在3个UASB反应器中和2种改性生物填料载体表面均可被检测到，并且无论是底泥亦或者改性生物填料载体上，C.jettenia为其中优势厌氧氨氧化菌（图6）。

图6 反应器底泥及填料载体表面微生物菌群结构属水平上的比较Fig.6 Composition of biofilm microorganismson two modified carriers and sludge in three

由图6可以看出：活性炭聚氨酯反应器及对照组的厌氧氨氧化菌丰度差异主要体现在活性炭聚氨酯上富集了一定数量的厌氧氨氧化菌；而投加改性聚乙烯塑料填料的厌氧氨氧化反应器，无论是底泥还是填料表面，其厌氧氨氧化菌的丰度都较活性炭聚氨酯反应器及对照组要高；投加改性聚乙烯塑料填料的反应器的底泥厌氧氨氧化菌丰度较对照组约高出50%。因此，投加了改性聚乙烯塑料填料的反应器在相同容积负荷条件下，其脱氮性能往往是最高的，活性炭聚氨酯次之，而最差的则为对照组。上述结果也表明改性聚乙烯塑料填料的投加能够更为有效促进厌氧氨氧化菌的富集。该结论与高梦佳等［25］的研究结果相反，可能是由于所用填料经目的性地改性后，增加了其对厌氧氨氧化菌的富集效果。

综合3个厌氧氨氧化反应器的脱氮性能、脱氢酶活性及微生物菌群结构分析结果可知：2种改性生物填料载体的投加对厌氧氨氧化反应器的脱氮性能均有一定的促进效果；并且相比于活性炭聚氨酯生物填料而言，无论是在对反应器脱氮性能的提高方面还是对厌氧氨氧化菌的富集方面，改性的聚乙烯塑料填料的效果明显较好。

3 结论

1）向厌氧氨氧化反应器内投加活性炭聚氨酯和改性的聚乙烯塑料填料均能在一定程度上提高厌氧氨氧化反应器的脱氮性能，并且相比于活性炭聚氨酯生物填料，改性聚乙烯塑料填料对厌氧氨氧化反应器脱氮性能的提高效果更为明显。随着反应器容积负荷的提高，3个反应器的脱氮性能开始出现差异，投加改性生物填料载体反应器的脱氮性能往往高于未投加改性填料载体的反应器；当反应器容积负荷提升至1.37 kg／（m3·d）时，添加活性炭聚氨酯及改性聚乙烯塑料填料的反应器，其总氮去除率仍分别为76.41%和82.89%，而未添加改性生物填料的反应器总氮去除率仅剩70.26%，改性聚乙烯塑料填料对厌氧氨氧化性能的强化最为显著。

2）通过扫描电子显微镜可在2种改性生物填料载体表面观察到明显的花椰菜结构，说明2种改性生物填料载体对厌氧氨氧化菌均具有良好的吸附效果。

3）投加改性填料载体的反应器底泥的脱氢酶活性均高于对照组，说明改性生物填料载体的投加能够提高反应器内厌氧氨氧化菌的活性。然而相对于活性炭聚氨酯而言，改性聚乙烯塑料填料表面生物膜的脱氢酶活性明显较高，脱氮效率最佳；反应器底泥及改性填料载体表面微生物脱氢酶活性差异导致3个厌氧氨氧化反应器脱氮性能不同。

4）通过高通量测序对3个反应器底泥及2种改性生物填料载体表面微生物进行菌群构成分析，发现投加改性生物填料的反应器，其厌氧氨氧化菌的总丰度高于对照组，说明改性生物填料的投加能够增加反应器对功能菌群的持留；并且投加改性聚乙烯塑料填料的反应器，底泥及填料表面厌氧氨氧化菌的丰度都明显较高，说明改性聚乙烯塑料填料在促进反应器性能等各方面都具有较强的优势。