高效液相色谱法测定半夏泻心汤物质基准中盐酸小檗碱的含量*

闫丽莉，宋小雪，陈忠新，张文娓，田 明

（黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040）

国家大力倡导对古代经典名方的研究，为了响应国家号召，对经典名方半夏泻心汤进行现代工艺研究[1]。半夏泻心汤为我国古代传统经典名方，同时也为国家首批下发的100个经典名方目录之一，出自于东汉时期著名医师大家张仲景的《伤寒论》，经几代人验证疗效确切，且应用十分广泛，对急慢性胃肠炎有很好的治疗效果[2-4]，本文对半夏泻心汤物质基准中盐酸小檗碱的含量进行测定，有利于进一步加强对物质基准的质量控制，同时也为半夏泻心汤的现代工业化生产研究奠定了基础[5-7]。

1 实验部分

1.1 仪器

Thermo-Sciencetific Ultimate 3000型高效液相色谱仪（Thermo公司）；FA2004型电子分析天平（力辰科技有限公司）；MP5200H型超声波清洗机（陕西鹏展科技有限公司）。

1.2 药材和试剂

乙腈（色谱纯中国Dikma公司）；纯化水；KH2PO4（天津市致远化学试剂有限公司）；十二烷基硫酸钠（天津市致远化学试剂有限公司）；H3PO4（AR天津市耀华化学试剂有限责任公司）；110715-201810盐酸小檗碱（中国药品生物制品检定所）；半夏泻心汤物质基准（自制）。

1.3 色谱条件的确定

选用十八烷基硅烷键合硅胶柱；流动相为乙腈-0.05moL·L-1KH2PO4溶液（50∶50）（每50mL中加十二烷基硫酸钠0.2g，用H3PO4调节pH值至4.0）；流速1mL·min-1，检测波长为345nm[8]。

1.4 对照品溶液的制备

取盐酸小檗碱适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含有65μg的溶液，即得。

2 结果与讨论

2.1 供试品提取方法的考察

2.1.1 提取方法的考察与结果分析 称取半夏泻心汤物质基准各0.25g，共3份，分别置于50mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇-盐酸（100∶1）的混合溶剂20mL，密塞，超声处理（功率250W，频率40kHz）10、20、30min，取出，摇匀，滤过，蒸干，残渣加甲醇-盐酸（100∶1）溶剂溶解，定容至10mL容量瓶中，即得。结果见表1。

表1 供试品提取方法结果Tab.1 Result table of extraction methods of samples

由表1可知，超声时间在10～30min时，测定的盐酸小檗碱含量的RSD值为1.16%，为确保充分提取出半夏泻心汤物质基准中盐酸小檗碱的含量，故将超声时间确定为20min。

2.1.2 供试品提取方法的确定 取半夏泻心汤物质基准0.25g，精密称定，置于50mL具塞锥形瓶中，加入甲醇-盐酸（100∶1）的混合溶剂20mL，密塞，超声处理（功率250W，频率40kHz）20min，取出，放冷，滤过，蒸干，用甲醇-盐酸（100∶1）的混合溶剂定溶于10mL容量瓶中，即得。

2.2 专属性试验

2.2.1 供试品溶液制备 同2.1.2项下处理方法。

2.2.2 对照品溶液制备 同2.1项下对照品制备方法。

2.2.3 阴性对照溶液制备 称取处方中除黄连外的药材（共计80g），按实验前期半夏泻心汤物质基准确定的最佳制备工艺，制备出缺黄连的物质基准，按2.1.2项下方法制备黄连阴性对照溶液。

2.2.4 试验方法 将2.2.1、2.2.2、2.2.3项下的溶液分别用0.45μm有机微孔滤膜滤过至液相小瓶中，放置于高效液相色谱仪中，设置每次自动进样10μL，依照1.3色谱条件测定，并记录峰面积，专属性考察结果表见表2，液相色谱图见图1。

表2 专属性考察结果Tab.2 Results of specificity investigation

图1 液相色谱图Fig.1 Liquid chromatogram

由表2及图1可知，盐酸小檗碱的出峰时间约为9.5min，在此标准品峰相近的保留时间内，阴性样品干扰峰仅有一个，测得峰面积为0.7328，占供试品峰面积的2.2%，阴性样品对盐酸小檗碱的检测影响较小，试验方法有效。

2.3 标准曲线的制备及线性范围的确定

取2.2.2项下盐酸小檗碱对照品溶液适量，经0.45μm有机微孔滤膜滤过至液相小瓶中，放置于高效液相色谱仪中，按照下表所示体积分别进样，记录峰面积，结果见表3，线性图见图2。

表3 线性关系考察Tab.3 Investigation table of linear relations

图2 盐酸小檗碱标准品线性图Fig.2 Linear diagram of standard berberine hydrochloride

由表3、图2可知，以含量及峰面积为横纵坐标进行线性回归，结果表明，盐酸小檗碱在0.26～1.04μg之间呈良好线性关系，得回归方程为∶Y=61.583X-0.9668，R2=0.999。

2.4 精密度试验

取半夏泻心汤物质基准0.25g，精密称定，照2.1.2项下的处理方法制成物质基准的供试品溶液，取同一供试品，仪器的程序设成自动进样10μL，接连测定6次，记录盐酸小檗碱峰面积，计算6组数据的RSD值。结果见表4。

表4 精密度试验结果Tab.4 Precision test results

由表4可知，以盐酸小檗碱峰面积作为测定指标，RSD值为1.08%（RSD＜3%），表明仪器精密度良好。

2.5 重复性试验

称取6份物质基准各0.25g，精密称定，照2.1.2项下方法平行制备6份供试品溶液，仪器程序设成自动进样，每次10μL，测定含量及RSD值，结果见表5。

表5 重复性试验结果Tab.5 Repeatability test results

由表5可知，重复性测定6批样品含量RSD值为1.35%（RSD＜5%），表明该测定方法重复良好。

2.6 稳定性试验

精密称取半夏泻心汤物质基准0.25g，按2.1.2项下方法处理得到供试品溶液，分别用0.45μm有机微孔滤膜滤过至液相小瓶中，放置于高效液相色谱仪中，设置序列及仪器方法，每间隔2h自动进样10μL，连续监测12h内盐酸小檗碱含量情况，计算RSD值。结果见表6。

表6 稳定性试验结果Tab.6 Stability test results

由表6可知，12h内所测定盐酸小檗碱含量较稳定，RSD值为0.98%（＜3%），说明该处理方法得到的供试品溶液在12h内测定均稳定。

2.7 加样回收试验

精密称取半夏泻心汤物质基准各0.12g，共6份，分别加入0.25mg·mL-1的盐酸小檗碱对照品溶液1mL，照2.1.2项下的方法制备半夏泻心汤物质基准的供试品溶液，仪器设置成自动进样，每次进样10μL，记录峰面积，测定回收率。结果见表7。

表7 加样回收试验结果Tab.7 Test results of sampling recovery

由表7可知，6批次的供试品回收率均在95%～105%之间，表明供试品处理方法加样回收率符合要求，准确稳定。

2.8 15批样品含量测定

精密称取15批次半夏泻心汤物质基准各0.25g，按2.1.2项下方法处理得到供试品溶液，分别用0.45μm有机微孔滤膜滤过至液相小瓶中，放置于高效液相色谱仪中，设置每次自动进样10μL，依照1.3色谱条件测定其含量及RSD值，结果见表8。

表8 15批样品含量测定结果Tab.8 Content determination results of 15 batches of samples

由表8可知，考虑到由于饮片的多批次及产地的不同，导致制备的15批半夏泻心汤物质基准中盐酸小檗碱含量的差异，测定的15批物质基准的盐酸小檗碱每剂含量在34.61～54.63mg之间，其质量离散度较小，均在均值的70%～130%合理波动范围之间，最终确定半夏泻心汤物质基准的盐酸小檗碱每剂含量范围为33.12～61.50mg。根据《古代经典名方中药复方制剂及其物质基准的申报资料要求》的相关要求，“含量测定的波动范围一般不超过均值的70%～130%，合理确定质量标准中相关质控项目质量要求上下限。”该方法中盐酸小檗碱含量范围的确定与此要求相符。

3 结论

通过高效液相色谱仪对半夏泻心汤物质基准中盐酸小檗碱含量进行测定，利用专属性、线性范围、精密度、重复性、稳定性、加样回收等方法学考察确定本测定方法的稳定性及准确性，为经典名方的开发与利用做铺垫，很好的促进中医药事业的发展[9,10]。