正交试验法优选瞿麦总黄酮的提取工艺

邝敏贤，区展龙，黄友安

广州中医药大学第三附属医院，广东 广州 510360

瞿麦首载于《神农本草经》，2020 年版《中国药典》（一部）规定其来源为石竹科植物瞿麦Dianthus superbusL.或石竹Dianthus chinensisL.的干燥地上部分，味苦，性寒，有通淋利尿、活血通经的功效，常用于治疗热淋、血淋、石淋、小便不通等病症［1］。瞿麦的主要化学成分有皂苷类、黄酮类、环肽类、酚酸类、多糖类等，其中黄酮类成分有山柰酚、槲皮素等。黄酮类成分具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等生物活性［2-3］。现代药理研究表明，瞿麦具有抗肿瘤、抗菌、抗氧化等药理活性，临床上具有广泛疗效［2］。瞿麦是医院泌尿外科的常用中药品种，进行临床处方调剂时经常可以瞿麦与萹蓄、车前子等共用。

目前，有关瞿麦中有效成分的提取工艺研究主要围绕总生物碱、总酚、总皂苷等，而有关黄酮类成分的提取工艺研究却鲜有报道。2021 年国家药典委员会发布第二批中药配方颗粒国家标准，其中瞿麦配方颗粒国家标准选择瞿麦总黄酮作为含量测定的指标。因此，本研究将瞿麦总黄酮提取率作为指标，分别对超声时间、乙醇浓度、料液比、超声提取功率4 个影响因素分别进行单因素试验，并根据实验结果进一步设计L9（34）正交试验，优选瞿麦黄酮类成分的超声提取工艺，为瞿麦黄酮类化合物的合理开发和临床应用提供数据支持。

1 仪器与材料

1.1 仪器

UV-2600i 型紫外-可见分光光度计（日本岛津仪器有限公司），Milli-Q Direct 型超纯水系统（德国Merck 公司），XP26 型百万分之一天平、ME204E 型万分之一天平（瑞士METTLER TOLEDO公司），HWS-28 型恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司），KQ-500DE 型数控超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司），高速中药粉碎机（浙江瑞安市永历制药机械有限公司）。

1.2 试剂与试药

芦丁对照品（批号：100080-202012，纯度：91.6%）购自中国食品药品检定研究院，无水乙醇和三氯化铝均为分析纯。瞿麦药材产地为河南，经广州中医药大学第三附属医院药学部黄志辉副主任中药师鉴定为石竹科植物石竹Dianthus chinensisL.的干燥地上部分，符合2020 年版《中国药典》一部瞿麦项下要求。

2 方法与结果

2.1 含量测定

2.1.1 芦丁标准曲线绘制精密称取芦丁对照品适量，置100 mL 量瓶中，加入50%乙醇溶解并定容至刻度，摇匀，配制成芦丁质量浓度为38.618 6 μg/mL 的对照品贮备液。依次精密量取芦丁对照品贮备液0、1、3、5、7、8 mL，置10 mL 量瓶中，加0.1 mol/L的三氯化铝溶液2 mL，加50%乙醇至刻度，摇匀。在40 ℃水浴中保温放置20 min，取出，快速冷却，放置20 min，以相应试剂为空白，照紫外-可见分光光度法（《中国药典》2020 年版四部通则0401），在410 nm 的波长处测定吸光度，以吸光度（Y）为纵坐标，浓度（X，μg/mL）为横坐标，绘制芦丁标准曲线［4］。其回归方程为Y=0.029 3X-0.003 1，r=0.999 9，结果表明芦丁在0～30.894 8 μg/mL 范围内具有良好的线性关系。

2.1.2 瞿麦供试品溶液吸光度的测定取瞿麦药材（过二号筛）约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入100 mL 50%乙醇，密塞，称定重量，超声提取（功率250 W，频率40 kHz）1 h，取出，放冷，再称定重量，用50%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5 mL，置10 mL 量瓶中，加0.1 mol/L 的三氯化铝溶液2 mL，加50%乙醇至刻度，摇匀。于40 ℃水浴中保温20 min，取出，快速冷却，放置20 min，以未加入0.1 mol/L 的三氯化铝溶液的瞿麦供试品溶液为空白，照紫外-可见分光光度法（《中国药典》2020 年版四部通则0401），在410 nm 的波长处测定吸光度［4］。并根据芦丁标准曲线计算样品中总黄酮浓度（μg/mL），按下式计算总黄酮提取率：总黄酮提取率（%）=样品中总黄酮浓度（μg/mL）×稀释倍数/106/样品质量（g）×100。

2.1.3 最大吸收波长的选择取芦丁对照品贮备液适量按“2.1.1”项下操作，在150～700 nm 进行全波长扫描，结果芦丁在410 nm 波长处有最大吸收，因此测定波长选定为410 nm。

2.1.4 精密度试验取芦丁对照品贮备液适量，按“2.1.1”项下方法操作并测定吸光度，重复测定6 次，记录吸光度。结果芦丁吸光度的RSD 为0.86%，表明该仪器的精密度良好。

2.1.5 重复性试验精密称取样品适量，共6 份，按“2.1.2”项下方法分别平行制备瞿麦供试品溶液6份，记录瞿麦供试品溶液在410 nm 下的吸光度。结果6份瞿麦样品中芦丁吸光度的RSD 为1.43%，表明该方法重现性良好。

2.1.6 稳定性试验精密吸取同一份瞿麦供试品溶液适量，分别于0、10、20、30、40、50、60 min 测定并记录吸光度。结果芦丁吸光度的RSD 为1.32%，表明瞿麦供试品溶液在60 min 内稳定。

2.1.7 加样回收试验取已知含量的瞿麦样品适量，精密称取9 份，每份约0.1 g，置具塞锥形瓶中，分为3 组，每组分别精密加入相当于含有量50%、100%、150%的芦丁对照品，按“2.1.2”项下方法分别制备瞿麦供试品溶液，测定并记录吸光度。结果平均回收率为100.48%，RSD 为2.06%，见表1，表明该方法准确性良好。

表1 总黄酮加样回收率试验结果

2.2 单因素试验

2.2.1 超声时间固定乙醇浓度为50%，料液比为1∶500，提取功率为250 W，分别在超声时间为20、30、40、50、60 min 的条件下进行超声提取，考察不同超声提取时间对瞿麦中总黄酮提取率的影响，总黄酮提取率结果见图1。结果表明，随着超声时间的增加，瞿麦总黄酮提取率呈先升高后降低的趋势，由于瞿麦样品中总黄酮的总量为定值，大部分总黄酮析出后，其含量便不再升高；且延长提取时间，可能导致瞿麦中黄酮化合物结构受到破坏。当超声50 min 时总黄酮提取率达到最高，故选择超声时间范围为40～60 min。

图1 超声时间对总黄酮提取率的影响

2.2.2 乙醇浓度固定超声时间为60 min，料液比为1∶500，提取功率为250 W，分别在乙醇浓度为30%、40%、50%、60%、70%的条件下进行超声提取，考察不同乙醇浓度对瞿麦总黄酮提取效果的影响，总黄酮提取率结果见图2。结果表明，随着乙醇浓度的升高，瞿麦的总黄酮提取率变化较为微弱，呈先上升随后降低的趋势，可能是因为高浓度乙醇引起细胞壁钙化，使总黄酮提取率下降［5］。当乙醇浓度为60%时总黄酮提取率达到最高但与50%浓度的提取率无明显区别，同时从节约成本的角度出发，故后续试验乙醇浓度固定为50%。

图2 乙醇浓度对总黄酮提取率的影响

2.2.3 料液比固定超声时间为60 min，乙醇浓度为50%，提取功率为250 W，分别在料液比为1∶200、1∶300、1∶400、1∶500、1∶600 的条件下进行超声提取，考察不同料液比对瞿麦中总黄酮提取效果的影响，总黄酮提取率结果见图3。结果表明，随着料液比的增加，瞿麦中总黄酮提取率呈先升高后基本保持不变的趋势。由于瞿麦总黄酮总量为一定值，当大部分总黄酮均溶出后，随着料液比的继续增加，其含量便不再升高，故总黄酮提取率不再升高［6］。当料液比1∶600 时总黄酮提取率达到最大值，故选择料液比范围为1∶400～1∶600。

图3 料液比对总黄酮提取率的影响

2.2.4 提取功率固定超声时间为60 min，乙醇浓度为50%，料液比为1∶500，分别在提取功率为200、250、300、350、400 W 的条件下进行超声提取，考察不同提取功率对瞿麦中总黄酮提取效果的影响，总黄酮提取率结果见图4。结果表明，随着功率的增加，总黄酮提取率呈先上升后降低的趋势，可能是因为功率过大容易引起温度升高，总黄酮结构受到影响，且过高的温度也可能使溶剂加速挥发，引起总黄酮提取率下降［7］。当提取功率为250 W 时，总黄酮提取率达到最大值，故选择提取功率范围为250 W～350 W。

图4 提取功率对总黄酮提取率的影响

2.3 正交试验

2.3.1 因素水平设计根据单因素试验的结果，以超声时间（A）、料液比（B）、提取功率（C）为考察因素，以总黄酮提取率为评价指标，按L9（34）正交表设计试验，选定的因素水平见表2。

表2 正交试验因素与水平表

2.3.2 结果分析按正交试验设计，测定各试验组总黄酮提取率，并对试验数据分别进行直观分析以及方差分析，试验结果见表3 及表4。由表3 极差R 值可知，各因素对总黄酮提取率的影响顺序由大到小依次为超声时间（A）>料液比（B）>提取功率（C），各因素不同水平影响由大到小分别为A2>A3>A1、B2>B1>B3、C1>C3>C2。由表4 离差平方和可知，各因素对总黄酮提取率贡献率顺序由大到小依次为超声时间（A）>料液比（B）>提取功率（C），与直观分析结果一致。其中超声时间（A）及料液比（B）对总黄酮提取率影响显著（P<0.05），提取功率（C）对总黄酮提取率影响不显著（P>0.05）。综合直观分析及方差分析结果，确定采用的最佳提取工艺为A2B2C1，即最佳提取工艺条件为取瞿麦药材（过二号筛）约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入100 mL 50%乙醇，密塞，称定重量，超声提取（功率250 W，频率40 kHz）50 min。

表4 方差分析结果

2.3.3 验证试验根据优选的提取工艺条件A2B2C1，取瞿麦药材（过二号筛）共3 份，每份约0.2 g，精密称定，进行三份平行验证试验，结果见表5。测得的瞿麦总黄酮提取率分别为0.288 3%，0.286 6%，0.280 1%，3 次测定的平均值为0.285 0%，RSD 为1.52%，表明该工艺稳定可行。

表5 验证试验结果（n=3）

3 讨论

近年来，黄酮类化合物因具有抗菌、抗炎、抗氧化等药理活性［8］，其提取工艺、含量测定、抗氧化活性等相关研究已逐渐成为研究领域热点之一。2020 年版《中国药典》（一部）瞿麦项下并无含量测定项，故本研究将瞿麦总黄酮提取率作为指标。总黄酮含量测定方法主要有高效液相色谱法（HPLC）、紫外-可见分光光度法（UV-Vis）等［9-10］。紫外-可见分光光度法设备要求低、成本相对低廉、检测速度快，故选用紫外-可见分光光度法测定瞿麦总黄酮提取率。与回流提取方法相比，超声提取法可借助超声波的空化效应，将植物细胞壁破坏，促进提取溶媒穿透植物细胞壁，从而达到较好的提取效果，具有操作简便、提取率较高的特点［11］。综合考虑提取效率及经济成本，以乙醇作为溶剂，既能达到较好的提取效果，又具有绿色环保的特点。

本研究通过单因素试验及正交试验综合考察，确定瞿麦总黄酮提取的最优工艺条件。单因素结果表明，瞿麦中总黄酮提取率随着超声时间、乙醇浓度、提取功率的升高都有呈先上升后降低的趋势，随着料液比的增加而呈升高后基本保持不变的趋势。正交试验结果表明，各因素对总黄酮提取率影响主次顺序为超声时间＞料液比＞提取功率，同时总黄酮的最优工艺条件为A2B2C1，即乙醇浓度为50%、料液比为1∶500、超声提取功率为250 W、超声时间为50 min。该提取条件下，瞿麦总黄酮提取率均值为0.285 0%，RSD<3%，表明该优选工艺的提取效果稳定，可为瞿麦总黄酮的进一步开发利用提供科学依据，也为瞿麦总黄酮的工业化生产提供一定的数据支持。