金鸡系列4 个剂型药品的质量标准研究

王银红，罗疆南，李靖云，陈征，胡亮，罗艳

湖南省药品检验检测研究院，湖南省药品质量评价工程技术研究中心，湖南 长沙 410001

金鸡系列品种（金鸡片/颗粒/胶囊/丸）处方包含6 味药材（金樱根、鸡血藤、千斤拔、功劳木、两面针、穿心莲），其药理作用为清热解毒，健脾除湿，通络活血［1-2］。查询国家药品监督管理局官网国产药品查询系统，共有4 家生产企业，9 个批准文号，4 个剂型，7 个规格，分布于全国3 个省（市、自治区）。经查询资料，金鸡系列制剂的原研制剂为金鸡颗粒（金鸡冲剂）［3］，其余剂型为在金鸡颗粒的基础上进行剂型改变得到的。现行质量标准情况为金鸡颗粒和金鸡胶囊收载于中药成方制剂第十六册［1］；金鸡丸为国家食品药品监督管理局国家药品标准YBZ09292006-2011Z；糖衣片收载于中药成方制剂第十八册［2］，三个企业的薄膜衣片均为国家食品药品监督管理局批准的单页标准，与糖衣片设置的检验项目一致。除金鸡丸外，其他三种剂型的质量标准基本一致，仅设置了功劳木和两面针的薄层色谱鉴别项，检验项目较少，方中君药金樱根，臣药鸡血藤、千斤拔，佐药两面针均无相关质控项目。本课题对金鸡系列品种（片/颗粒/胶囊/丸）中六味药材的薄层色谱鉴别方法及含量测定方法分别进行了研究，并建立了其中四味药材的薄层色谱方法及金鸡系列品种（金鸡片/胶囊/丸）的含量测定方法。同时，对原标准中两面针和穿心莲两味药材的薄层色谱方法进行了优化，建立了该系列品种更为完善的定性及定量检验标准，可为全面地评价金鸡系列品种的质量提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

半自动薄层点样仪（Scanner 3/REPROSTAR3，瑞士卡玛公司）；电子分析天平（AE240、XSE205DU,德国梅特勒公司）；高效液相色谱仪（LC-20AT，日本岛津公司）；超声清洗仪（CG-300，张家港市港威超声电子有限公司）。

1.2 试剂与试药

实验中所用金樱根（批号121481-201103）、鸡血藤（批号121510-201105）、芒柄花素（批号110857-201412）、盐酸小檗碱（110713-201212，供含量测定用，纯度86.7 %）、盐酸药根碱（121481-200802，供鉴别用）、盐酸巴马汀（110732-200907，供含量测定用，纯度86.1 %），均为中国食品药品检定研究院国家药品标准物质；盐酸药根碱纯度为98.0 %（采用面积归一化法计算）。试剂中除甲醇、乙腈（色谱纯，Honeywell）外均为国药集团化学试剂有限公司生产分析纯试剂；水为超纯水。金鸡丸（批号：20160101、20160305、20160306）由D 企业提供，金鸡胶囊（批号：7516018、1115004、7516013）由A 企业提供，金鸡片（批号：2616002、QC001、20160502）、金鸡颗粒（批号：1315003、QC002、20160304）分别由A、B 及C 企业提供，阴性样品按处方自制。

2 实验方法与结果

2.1 TLC 方法研究与统一

2.1.1 新增金樱根的TLC新增了金鸡片/颗粒/胶囊三种剂型的金樱根薄层色谱方法，修订了金鸡丸中金樱根的薄层方法，对四种剂型方法进行了统一。本方法以金樱根对照药材为对照，取供试品12 片（糖衣片）/8 片（薄膜衣片）/1 袋（颗粒）/5粒（胶囊）/3 g（丸），研细，经乙醇超声处理后，提取液蒸干，用0.05 mol/L 氢氧化钠溶液20 mL溶解，用乙酸乙酯萃取，提取液蒸干，再用乙酸乙酯1 mL 溶解即得。对照药材溶液的制备方法同供试品溶液，浓度为3 g/mL。薄层板采用硅胶G板，展开剂选用二氯甲烷-甲醇（8.5∶1.5），显色采用喷以10 %硫酸乙醇溶液后加热显色。经检验，四种剂型样品均检出金樱根，阴性对照无干扰。结果见图1。

图1 金樱根TLC图谱

2.1.2 新增鸡血藤的TLC新增了金鸡片/颗粒/胶囊三种剂型的鸡血藤薄层色谱方法，修订了金鸡丸中鸡血藤的薄层方法，对四种剂型方法进行了统一。本方法以芒柄花素对照品和鸡血藤对照药材为对照，取供试品4 片（糖衣片）/3 片（薄膜衣片）/1 袋（颗粒）/3 粒（胶囊）/1 g（丸），研细，经乙醇回流提取后，提取液蒸干，用乙酸乙酯1 mL 温热溶解，即得。对照药材溶液的制备方法同供试品溶液，浓度为2 g/mL。芒柄花素对照品用甲醇制成1 mg/mL 的溶液，即得。薄层板采用硅胶G 板，展开剂使用三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇（30∶6∶0.3），展开晾干后在紫外光灯（254 nm）下检视。经检验，四种剂型样品均检出鸡血藤及芒柄花素，阴性对照无干扰。结果见图2。

图2 鸡血藤TLC图谱

2.1.3 新增千斤拔的TLC新增了金鸡片/颗粒/胶囊/丸四种剂型的千斤拔薄层色谱方法，并对四种剂型方法进行了统一。本方法以千斤拔对照药材为对照，供试品溶液取金樱根薄层鉴别项下供试品溶液。对照药材溶液的制备同供试品溶液，浓度为1 g/mL。薄层板采用硅胶G 板，展开剂使用环己烷-丙酮（8∶3），显色采用喷以10 %磷钼酸乙醇溶液后加热显色。经检验，四种剂型样品均检出千斤拔，阴性对照无干扰。结果见图3。

图3 千斤拔TLC图谱

2.1.4 新增两面针的TLC新增了金鸡片/颗粒/胶囊/丸四种剂型的两面针薄层色谱方法，并对四种剂型方法进行了统一。本方法以两面针对照药材为对照，取供试品10 片（糖衣片）/7 片（薄膜衣片）/8 g（颗粒）/3.5 g（胶囊）/3 g（丸），研细，水溶后用浓氨试液调pH 值至11，用二氯甲烷萃取，提取液蒸干，加二氯甲烷1 mL 溶解，即得。对照药材按照制法加水煮沸30 分钟后，同供试品溶液制备方法制备为浓度为1 g/mL 的溶液。薄层板采用硅胶G 板，展开剂使用二氯甲烷-甲醇-浓氨试液（40∶1∶0.2），展开晾干后在紫外光灯（365 nm）下检视。经检验，四种剂型样品均检出两面针，阴性对照无干扰。结果见图4。

图4 两面针TLC图谱

2.1.5 功劳木的TLC 修订对四种剂型功劳木的薄层方法进行了修订，用二氯甲烷替代三氯甲烷，并优化了供试品的制备方法。本方法以盐酸小檗碱对照品、盐酸巴马汀对照品及功劳木对照药材为对照，供试品取样量修订为3 片（糖衣片）/2片（薄膜衣片）/4 g（颗粒）/2 粒（胶囊）/1 g（丸），提取过程中用二氯甲烷替代三氯甲烷，其他同原标准。对照药材溶液制备同供试品溶液，浓度为0.2 g/mL；对照品溶液均采用甲醇配制成浓度为0.2 mg/mL 溶液。薄层板采用硅胶G 板，展开剂使用正丁醇-冰乙酸-水（7∶1∶2）上层溶液，展开晾干后在紫外光灯（365 nm）下检视。经检验，四种剂型样品均检出功劳木、盐酸小檗碱及盐酸巴马汀，阴性对照无干扰，结果见图5。

图5 功劳木TLC图谱

2.1.6 穿心莲的TLC 修订修订了四种剂型穿心莲薄层色谱鉴别中供试品制备方法，增加脱水穿心莲内酯对照品为对照，并将现行标准中的展开剂三氯甲烷改为二氯甲烷。其余条件均与原标准一致。经检验，四种剂型样品均检出穿心莲、穿心莲内酯及脱水穿心莲内酯，阴性对照无干扰，结果见图6。

图6 穿心莲TLC图谱

2.2 含量测定方法研究与统一

2.2.1 色谱条件采用安捷伦公司250 mm C18 色谱柱，型号Agilent C18 TC（2）（内径4.6 mm，粒径5 µm）；流动相采用乙腈-0.1%磷酸溶液梯度洗脱：0～20 min，15 %→20 %乙腈；20～60 min，20 %乙腈；检测波长：345 nm；流速：0.8 mL/min；柱温30 ℃。

2.2.2 对照品溶液的制备用甲醇作为溶剂，分别配制盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、盐酸药根碱对照品溶液，作为对照品母液（浓度均约为0.2 mg/mL）；对照品溶液为对照品母液加甲醇稀释而成，浓度均约为0.004 mg/mL。

2.2.3 供试品溶液的制备金鸡片除去包衣，研细，取约0.7 g/金鸡胶囊研细，取约0.5 g/金鸡丸研细，取约0.5 g；精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入盐酸-70 %乙醇溶液（1∶100）50 mL（金鸡胶囊为25 mL），称定重量，超声处理30 min，放冷，用溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.4 阴性对照溶液的制备按样品制法制备缺功劳木的阴性样品，取适量，按供试品溶液的制备方法制备阴性对照溶液。

2.2.5 专属性试验分别吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液按上述色谱条件测定，结果阴性对照无干扰，样品中各色谱峰分离度良好。结果见图7。

图7 金鸡片HPLC色谱图：A.对照品溶液；B.阴性溶液；C.供试品溶液

2.2.6 线性关系的考察精密吸取“2.2.2”项下的对照品母液，分别稀释成盐酸药根碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱的系列对照品溶液，精密吸取上述对照品溶液各5 μL，分别按“2.2.1”项下的色谱条件测定，以峰面积（Y）为纵坐标，进样量为（X，ng）为横坐标，绘制标准曲线，结果表明：盐酸小檗碱对照品、盐酸巴马汀对照品、盐酸药根碱对照品均线性关系良好，其线性范围分别为4.007～1 335.8 ng、3.245～1081.7 ng、3.320 1～1 106.7 ng，线性方程分别为Y盐酸小檗碱=4 747.1x-4705 7，R2=0.999 5；Y盐酸巴马汀=4 883x-43 608，R2=0.999 4；Y盐酸药根碱=5 904.3x+2871.5，R2=1.000 0。

2.2.7 精密度试验按“2.2.1”项下色谱条件，精密吸取对照品溶液5 μL，连续进样6 次，测定峰面积，结果盐酸小檗碱峰面积、盐酸巴马汀峰面积、盐酸药根碱峰面积的RSD 分别为1.3 %、1.6 %、1.6 %，结果表明仪器进样精密度良好。

2.2.8 稳定性试验分别测定盐酸小檗碱对照品、盐酸巴马汀对照品、盐酸药根碱对照品于配制后的0、4、9、14、19、24 h 的峰面积，其RSD 分别为0.9 %、1.1 %、0.9 %，表明对照品溶液在配制后24 h 内稳定。

2.2.9 重复性试验取同一批号（金鸡片批号：2 616002；金鸡胶囊批号：7 516018；金鸡丸批号：20160101）样品，按“2.2.3”供试品处理方法各平行制备6 份供试品溶液，依法测定盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、盐酸药根碱三种成分的含量。结果见表1。

表1 重复性试验结果表（n=6）

2.2.10 加样回收率试验取已知含量的样品（同重复性项下）各6 份，金鸡片0.35 g/金鸡胶囊0.25 g/金鸡丸0.25 g，精密称定，分别置具塞锥形瓶中，精密加入盐酸药根碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱对照品适量，按“2.2.3”供试品处理方法处理，测定，计算加样回收率。结果见表2。

表2 回收率试验结果表（n=6） %

2.2.11 样品的含量测定取不同批次的样品，按“2.2.3”供试品处理方法制备，测定，结果见表3。

表3 样品含量测定结果（n=2）

3 讨论

3.1 薄层色谱鉴别药味的选择

金鸡系列制剂中金鸡片、金鸡颗粒及金鸡胶囊原质量标准均仅建立了功劳木和穿心莲的薄层色谱鉴别，而方中君药金樱根，臣药鸡血藤、千斤拔及佐药两面针［4］均无有效的质控方法。因此，本课题对四种剂型中该4 味药材进行了薄层色谱鉴别的研究［5-7］，建立了相应的薄层色谱鉴别方法，同时，对本系列制剂中穿心莲和功劳木的薄层色谱方法进行了改进，增强了系列制剂质量的可控性。

3.2 含量测定指标的选择

结合四种剂型特征图谱的研究结果［8-9］可知，样品中主要色谱峰归属于金樱根及功劳木，而鸡血藤、千斤拔、两面针及穿心莲中的主要成分峰均较小。因此，选择可同时测定方中金樱根和功劳木的含量测定色谱条件，对样品进行研究，样品色谱图中，金樱根的三个特征峰暂无对照品，功劳木中非洲防己碱量太小，且杂质峰有干扰，均无法定量，故仅对功劳木中的盐酸小檗碱、盐酸巴马汀和盐酸药根碱三种成分的总量进行了定量研究，建立并统一了金鸡丸、金鸡片、金鸡胶囊中的含量测定方法。由于金鸡颗粒样品中盐酸药根碱、盐酸巴马汀及盐酸小檗碱的含量均极低，未达到定量限以上，故暂未建立金鸡颗粒含量测定方法。

3.3 结果分析

实验结果发现金鸡颗粒相较于其他剂型样品，各薄层色谱斑点较淡，特别是千斤拔的薄层鉴别，但为了严格控制制剂质量，防止少投料、不投料以及采用质量较差的药材投料的情况发生，仍将千斤拔的薄层鉴别方法纳入该制剂质量标准。

从两面针的薄层色谱图中可以看出，不同企业的样品色谱行为差异较大，表明不同企业采用的两面针药材在基源、质量等方面均有差异。而现阶段市场上部分两面针药材为药农散种，极易造成基源混乱、质量参差不齐的现象。故建立两面针的质控方法，并结合毛两面针素的筛查［10-11］，可以有效地控制两面针投料药材的真伪及质量，对系列制剂的质量评价具有非常重要的意义。

本研究建立了金鸡系列品种（金鸡片/胶囊/丸）中三种生物碱的含量测定方法。从含量测定结果来看，不同剂型、同一剂型不同生产企业之间的测定结果差异均较大，该方法可有效地用于金鸡系列品种质量分析和评价中。