microRNA与功能性肠病

鄢香芸 姚俊鹏 张微 杨雨晴 牟林轩 陈敏 李瑛

1成都中医药大学针灸推拿学院/第三附属医院（成都610075）；2成都中医药大学教务处（成都611137）；3成都中医药大学临床医学院/附属医院（成都610075）；4成都中医药大学研究生院（成都610075）

功能性肠病（functional bowel disease，FBD）是由肠道功能紊乱导致的以腹痛、腹胀、和排便习惯改变等为主要症状的一系列肠道疾病，临床以肠易激综合征（irritable bowel syndrome，IBS）和功能性便秘（functional constipation，FC）最常见［1］。FBD 由多种因素诱发，肠屏障/运动功能、内脏高敏感性、炎症反应、肠道菌群失调及脑⁃肠互动异常等因素可能参与FBD 的发病机制。微小RNA（microRNA，miRNA）是一类长约22 个核苷酸，进化上高度保守的内源性、非编码单链RNA，与多种疾病的发生发展密切相关。miRNA 在基因网络调节中发挥核心作用，其代表了一种新的作用模式，具有精确传递信号和放大信号的能力［2］。越来越多的证据表明，miRNA 通过对FBD 靶基因的调控及相关信号通路的活化在肠黏膜屏障、肠道动力、内脏超敏、炎症反应等方面发挥重要作用。深入研究miRNA与FBD 的关系对阐释该类疾病的潜在生物标志物、治疗靶标及发病机制等方面具有重要意义。目前miRNA 在功能性肠病中的作用已是研究热点，因此本文将miRNA 在FBD 中作用的研究进展综述如下。

1 microRNA 概述

miRNA 指在内源性非编码RNA 中一类长度约为22 个核苷酸的单链小分子RNA，其靶基因种类繁多且数目巨大，广泛地参与到许多细胞信号转导系统中。miRNA 经由三个阶段加工成熟：首先在细胞核中，miRNA 被RNA 聚合酶Ⅱ转录为含有5′帽和3′聚（A）尾的pri⁃microRNA；之后由RNaseⅢ酶Drosha 和双链RNA 结合蛋白DGCR8 组成的复合体切割得到长度约为70 个核苷酸的前体miRNA；最后前体miRNA 被转运蛋白运出到细胞质，由另一种RNase Ⅲ型酶Dicer 和AGO 蛋白加工处理为长度约22 个核苷酸的成熟miRNA。miRNA可通过交叉调节、自我调节、可逆性调节等方式在转录后水平与靶mRNA 特异性的碱基互补配对，引起靶mRNA 降解或抑制其翻译，实现靶基因表达的负调控［3］。miRNA 不仅是遗传信息的内源性调控者，也是细胞间远距离通讯的媒介。研究证实，miRNAs 在体液中经细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）或胞外小体稳定迁移，被靶细胞内吞后介导信号的远距离传导［4］。每个miRNA 可同时调节多个靶基因，不同的miRNA 也可以协同调控同一靶基因，由此形成复杂的调控网络，精细调控基因的表达，广泛参与细胞的增殖、分化和凋亡等多个环节，与多种疾病的发生发展密切相关［5］。

2 microRNA 在FBD 不同组织中的表达

MARTĹNEZ 等［6-7］分析了FBD 和健康受试者肠组织中miRNA 的表达，发现miR⁃16 和miR⁃103 在IBS⁃D 患者空肠黏膜中的表达显著下调。而在慢传输型便秘（slow transit constipation，STC）患者结肠组织中，存在13 个表达上调的miRNA。进一步研究发现，体内诱导的STC 大鼠模型和体外培养的结肠平滑肌细胞中，过表达的Let⁃7f 可能通过下调SCN5A 基因的表达，降低钠离子通道NaV1.5 的电流密度和肠道平滑肌收缩性，进而减缓结肠传输功能。提示Let⁃7f 可能作为肠道传输功能的分子调节器，在STC 或其他肠道动力性疾病的病理生理中扮演重要的角色。

miRNA 不仅定位于结肠细胞内，还会被转运到细胞外，可以在血液、尿液等体液中检测其含量。GUO 等［8］发现IBS⁃D 患者血清中miR⁃1305、miR⁃575、miR⁃149、miR⁃190、miR⁃135a、miR⁃210、miR⁃148a 和miR⁃151⁃3p 表达显著上调；而miR⁃22、miR⁃483⁃3p、miR⁃194、miR⁃887、miR⁃1、miR⁃127⁃5p 和miR⁃892b 表达明显下调。监测外周血中miRNA 的表达水平可能为FBD 的临床诊断提供了一种非侵入性的生物学指标。血液微泡是EVs 的一种，能通过弥散、内吞等方式进入靶细胞，转运特异性蛋白、miRNA 等生物活性物质，促进细胞间信息交流。IBS⁃D 患者血液微泡中miR⁃29a 表达增加，推测其可作为肠膜通透性增强的IBS⁃D 患者的独特分子标记物［9］。此外，IBS 不同亚型患者外周血中miRNA 表达也存在差异。不确定型和混合型IBS 患者血清中miRNA⁃144、miRNA⁃29a 和miRNA⁃200a 表达水平显著高于其他亚型。而单纯便秘型和腹泻型IBS 仅miRNA⁃29a 和miRNA⁃200a 表达水平存在差异［10］。由此可见，miRNA 在外周血的差异表达为临床IBS 分型及诊断提供参考。

在FBD 动物模型的研究中，有学者运用液相芯片技术结合RT⁃PCR 验证的方法，发现在内脏超敏大鼠结肠黏膜中，let⁃7f、let⁃7i、miR⁃130b、miR⁃29a、miR⁃132、miR⁃21 和miR⁃375 的表达上调，而miR⁃24、miR⁃31a、miR⁃192、miR⁃221 和miR⁃223 的表达下调［11］。在吗啡加大黄诱导的STC 雌鼠结肠组织中，miR⁃128 的表达显著下调，与该团队前期的临床研究结果一致，这显示出miR⁃128 作为STC诊断生物标志物的运用前景［12］。

miRNA 在外周血和肠组织中存在差异性表达（表1），表明miRNA 可能参与调节FBD 的发生发展，这为FBD 的生物学诊断提供了新靶标。

表1 部分miRNA 在功能性肠病中的表达Tab.1 The expression of miRNAs in functional bowel diseases

3 miRNA与FBD 发病机制

3.1 miRNA与肠黏膜屏障肠黏膜屏障分为机械屏障、免疫屏障、生物屏障与化学屏障，各个屏障结构和功能上的完整由紧密连接蛋白、促炎症细胞因子和肠道菌群等共同维持［13］，能有效阻挡致病微生物和有毒化合物进入循环，维持机体内外环境的稳态。屏障受损可导致肠道功能紊乱，甚至败血症和多器官功能障碍等全身性病变［14］。越来越多的证据表明，miRNA 在基因网络调控中发挥重要作用，能从多种途径调控相应的靶基因调节肠屏障功能。

3.1.1 紧密连接紧密连接是机械屏障中最为重要的一环，主要包括咬合蛋白（Occludin）、闭合蛋白（Claudins）、连接黏附分子（JAM）和闭合小环蛋白（ZOs）。这四种跨膜蛋白和分子将相邻的肠上皮细胞连接在一起，维持细胞极性和黏膜屏障功能［15］。

在IBS⁃D 患者空肠活检组织中，miR⁃125b 和miR⁃16 表达降低，靶向上调紧密连接蛋白的表达，促进肠上皮屏障功能恢复［16］。体内研究发现，IBS⁃D 模型小鼠结肠miRNA⁃29a 表达升高，靶基因ZO1和CLDN1 表达降低，结肠黏膜损伤进行性加重；敲除miR⁃29 基因后，可显著上调CLDN1 和NKRF的表达来逆转肠黏膜的高通透性［9，17］。由此表明miR⁃29a 可通过靶向抑制紧密连接蛋白加重肠黏膜屏障损伤。另一项体外研究发现miR⁃144 对紧密连接蛋白也具有类似的调控作用［18］。

3.1.2 免疫与炎症反应低等级的粘膜炎症和免疫激活与FBD 免疫屏障功能损伤和神经元异常敏感性有关。巨噬细胞和肥大细胞作为一类重要的固有免疫细胞群，广泛分布于皮肤、消化道和气道等部位，以及时应对环境中的变应原做出免疫应答。当机体受到外界刺激，如微环境改变，生理和心理应激等均可使肠道内大量的炎症细胞迅速活化，释放多种生物活性介质和细胞因子，引发内皮和上皮的通透性增加［19-20］。而miRNA 作为一种重要的细胞间通讯分子，亦参与调节胃肠道炎症反应。有研究表明［21］，FC 患者结肠组织中异常增加的巨噬细胞和肥大细胞与miR⁃128 表达下调相关，且过表达的miR⁃128 可下调FC 患者结肠组织中肥大细胞数量，抑制胃肠道炎症反应。此外，miR⁃181c⁃5p 可以负调控炎性因子IL1A 的表达，减轻由冰醋酸灌肠联合直肠球囊刺激诱导的IBS 大鼠的肠道炎症反应［22］。类胰蛋白酶/PAR2 是经典的炎症信号通路。研究发现，miRNA⁃490⁃5p可激活肥大细胞类胰蛋白酶/PAR2 信号通路，诱发IBS⁃D 肠道黏膜的持续低度炎症反应［23］。

3.1.3 肠道菌群肠道菌群是肠道生物屏障中的重要部分，参与肠黏膜上皮细胞的增殖、分化。肠道微生物群的失衡可能促进病原体与肠壁粘附，损害肠屏障功能［24］。

miRNA 可作为宿主细胞与肠道细菌交流的桥梁，由宿主细胞发送后进入细菌内，调节细菌基因的表达和生长，维持肠道稳态［25］。研究发现肠上皮细胞和Hopx 基因阳性细胞（如杯状细胞）的miRNA 可进入肠道细菌体内，靶向调节细菌相关基因转录，造成肠道菌群相关代谢途径的改变，影响细菌生长；而miRNA 缺陷型小鼠更容易出现肠道菌群紊乱，在给予粪便miRNA 移植后可重塑其肠道菌群并减轻胃肠道症状［26］。MANSOUR 等［27］首次研究了大肠菌群和血清miRNA⁃199b 水平的具体关系，发现与健康对照组相比，IBS 及不同亚型患者粪便培养中大肠菌群数量显著增加，血清中miRNA⁃199b 表达明显下降，两者呈负相关，表明miRNA 可能对肠道菌群起负调控的作用。

此外，肠道菌群也能调节miRNA 在FBD 中的表达。肠道共有细菌过分泌的肽聚糖可通过Toll样受体2/4 信号途径诱导肠上皮细胞miR⁃21⁃5p的转录，抑制厌氧菌、梭状芽孢杆菌Ⅳ等有益菌的翻译，导致SCFAs、二氧化碳、甲烷等含量减少［28］。有研究发现，乳酸杆菌L.caseiLC01 通过抑制肠上皮细胞中miR⁃144 的表达水平，上调紧密连接蛋白的表达，促进IBS 患者肠上皮屏障功能恢复［18］。当前，益生菌制剂治疗FBD 的有效性已被证实［29］，但miRNA与肠道菌群的相关性在FBD 中的研究相对较少，值得深入探讨两者的关系和调控机制，为FBD 的临床诊断和治疗提供新靶点。

3.2 MicroRNA与内脏高敏内脏高敏指内脏组织对刺激过度反应，与神经信号的传导密切相关。有研究者通过慢病毒基因沉默技术使miRNA⁃490⁃5p 表达下调，降低内脏高敏模型大鼠的结肠敏感程度［30］。

miR⁃199a 能抑制瞬态受体势叶片蛋白1 型（TRPV1）离子通道的活性，减弱感觉神经元的信号传导；腹腔注射lenti⁃miR⁃199a 前体可上调miR⁃199a 的表达，减少TRPV1 信号来降低内脏超敏反应［31］。提示miR⁃199a 的降低可能是IBS 患者内脏高敏的关键因素。而miR⁃199 前体可能是内脏疼痛患者的候选治疗方法。大麻素受体1（CNR1）是内脏超敏的重要调节剂，与FBD 中的症状表型、疼痛知觉、神经传播抑制和结肠转运有关［32］，抑制CNR1 的表达可增强内脏敏感性。体内实验表明，miR⁃200a 可通过下调CNR1 和血清素转运体SERT的表达来诱导内脏超敏，加重或导致IBS⁃D 的发病［33］。

在WAS 诱导的IBS 小鼠的结肠上皮细胞中，神经递质5⁃HT 受体HTR7 是miRNA⁃29a 的靶基因；敲除IBS 小鼠miRNA⁃29a 能增加HTR7 水平，减轻胃肠道症状和腹痛严重程度。体外实验证实，miRNA⁃29a 抑制剂增强了HTR7 的表达，而模拟miRNA⁃29a 可下调肠道上皮细胞中HTR7 的表达［34］。表明miRNA⁃29a 可以负性地调节HTR7 的表达，miRNA⁃29a 抑制剂在肠道高敏的预防和治疗中有应用价值。

3.3 miRNA与肠动力肠道动力失调是FBD发病的重要机制。研究表明，miR⁃let⁃7f、miR⁃let⁃7e、miR⁃200a⁃3p 和miR⁃429 可通过抑制靶基因SCN5A的表达，降低结肠平滑肌细胞NaV1.5 通道的电流密度，进而增加平滑肌条收缩频率及振幅，改善肠道动力［7］。平滑肌细胞特异性敲除miRNAs 基因的小鼠，平滑肌表型、功能及基因表达谱急剧变化这一现象也佐证上述观点［35］。

肠道间质细胞（interstitial cell of cajal，ICC）分布于胃肠道内各肌层，是肠神经元与平滑肌细胞（smooth muscle cell，SMC）的中间媒介。ICC 还是胃肠慢波活动的起搏细胞，除极化后触发慢波，通过缝隙连接传递至SMC，引起平滑肌收缩。有团队［36-38］运用基因芯片技术检测STC 患者病变结肠组织中miRNA 的表达，发现miR⁃128 和miR⁃129 表达明显下调。为进一步探索miRNA 调控肠动力的信号通路，该团队从重度STC 患者病变结肠组织中取样，发现miR⁃128 可通过调节SCF 和IGF 信号通路改变结肠ICC 的形态；而miR⁃129 可能通过调控N 乙酰氨基半乳糖基转移酶1/转化生长因子⁃β1信号通路，诱导ICC 细胞转分化，影响肠道蠕动。在STC 大鼠模型结肠组织中，miR⁃222 过表达使c⁃kit 和干细胞因子表达水平下降，诱导ICC 细胞凋亡和自噬过度［39］。这些研究充分证实，miR⁃128、miR⁃129 和miR⁃222 可通过调节胃肠动力相关细胞的形态和功能参与FBD 的发病机制，是FBD 的重要研究靶点。

4 讨论

功能性肠病是一类以慢性或反复发作的肠道症状为诊断标准的非器质性疾病，以IBS 和FC最常见。流行病学调查研究显示，FBD 患病率为28.6%～ 31.7%［40］，其高发病率和病程的持久性严重影响了患者的生活质量和身心健康。临床上FBD 的诊断缺乏“金标准”，往往是结合临床表现、肠镜检查等，排除其它器质性肠道疾病后确诊；而治疗多是以改善症状为主的多学科综合模式。研究发现［41］，约有46%的FBD 患者常陷入反复就医的痛苦当中，加重了社会经济和医疗的负担。因此，当前亟待建立基于分子水平的FBD 精准化的诊断和治疗体系。

4.1 miRNA与FBD 诊断FBD 的诊断和鉴别诊断目前仍依赖于临床症状，罗马IV 认为FBD 以病理生理特征的联系存在于一个症状谱中，其中FC患者也可能伴随腹痛或腹胀［42］，这极大增加了IBS和FC 鉴别诊断的难度。miRNA 在FBD 患者不同组织和疾病分型的表达中存在差异，而血液和体液中的miRNA 稳定性较高，有望成为疾病诊断、鉴别诊断和精准分型的非侵入性标志物。同时，对FBD 病情的评估也需要有效的生物标志物。FBD患者的症状往往不能代表肠道功能障碍的严重程度，若以患者的症状指导临床用药往往会导致对FBD 患者的不当治疗。研究显示约有25%的FBD 患者没有明显的肠道症状却接受了过度的临床治疗［43］。GUO 等［8］研究发现miRNA 的表达可能与病情严重程度相关，IBS 患者外周血miR⁃148a⁃3p 的水平随腹痛程度的减轻而显著下降，这为临床上把控FBD 的病情进展和预后指明了方向。

4.2 miRNA与FBD 治疗调控miRNAs 的水平可一定程度上缓解肠功能紊乱，因此miRNAs 可作为FBD 的潜在治疗靶标。根据其在疾病发生发展中发挥的作用不同（表2），主要采取抑制致病性miRNA 或模拟关键miRNA 等治疗策略。许多miRNA 的潜在治疗作用已通过反义寡核苷酸［9］、过表达［22］、siRNA［35］、CRISPR/cas9［34］、shRNA［44］等多种技术手段在FBD 动物模型上得到验证。在IBS 小鼠模型中，利用反义寡核苷酸技术抑制miR⁃24 的表达能增加近端结肠的疼痛阈值，有效减轻胃肠道症状和腹痛严重程度［45］。研究发现［17，34］，miR⁃29a 抑制剂能精准调控ZO1、CLDN1 和HTR7等靶基因的表达，同时逆转内脏高敏，肠屏障损伤等多个病理过程，为FBD 的靶向治疗提供参考。此外，FBD 患者个体差异明显，深入挖掘不同患者的核心miRNA 有助于实现FBD 的个体化治疗。

表2 不同miRNA 在功能性肠病中的作用机制Tab.2 The mechanism of miRNAs in functional bowel diseases

但是近年来以RNA 为基础的治疗方法在FBD中发展较缓慢，功能性腹泻、餐后不适综合征等疾病的相关研究尚待开展。筛选每种疾病类型或不同人群的核心miRNA 仍是极大的挑战。在临床应用中，也可能面临潜在毒性和脱靶等问题。因此今后应继续开展大量研究，深入探讨miRNA 在FBD 中的调控机制，实现精准化诊疗理念向临床应用的转化。