人参皂苷Rb1对高氧诱导新生仔鼠肺损伤的改善作用及机制研究

农常亮 黄楚洪 冯金明 徐千惠 何潇 莫锦丽 史学凯 黄玉维

南宁市第二人民医院1儿科，2介入超声科（南宁530031）

氧疗是临床常用的治疗措施之一，可显著提高血氧饱和度，满足机体组织器官对氧气的需求［1］。高浓度氧疗被广泛应用于危重新生儿救治中，大幅度提升了低血压症新生儿及早产儿存活率，但长时间处于高氧环境可造成肺损伤，进而发展为不可逆性肺纤维化，造成新生儿支气管肺发育不良，严重影响患儿成长［2］。目前临床对新生儿高氧肺损伤尚无有效治疗手段，多采用激素类抗炎药物及肺表面活性剂，但效果不理想且副作用强，故未能得到推广。因此，寻找安全、高效的预防方式，对于预防及改善新生儿高氧肺损伤、减少肺功能障碍、瘫痪、智力发育缓慢等后遗症具有积极意义。人参皂苷Rb1（ginsenoside Rb1，G⁃Rb1）是自中药人参中提取的一种固醇类化合物，具有多种生物学功能，如抗氧化、抗炎、增强机体免疫力、延缓衰老、提升记忆力等［3］。有研究表明［4］，G⁃Rb1 可降低大鼠肺泡组织氧化酶活性，减缓慢阻肺病理改变，从而治疗肺气肿，提示其肺功能保护作用。然而，目前鲜有关于其对新生儿高氧肺损伤治疗的研究。本研究通过建立新生仔鼠高氧肺损伤模型，观察G⁃Rb1 对新生仔鼠高氧肺损伤的改善作用，并探讨相关机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物SPF 级SD 大鼠20 只，雌雄比例各半，9 周龄，体质量（300±50）g，购自上海灵畅生物科技有限公司，生产许可SCXK（沪）2018⁃0003。

1.2 药物、主要试剂、仪器G⁃Rb1（纯度>99%），上海沪震实业有限公司；核因子E2 相关因子2（nuclear factor⁃E2 related factor2，Nrf2）/抗氧化反应元件（antioxidant response elements，ARE）通路抑制剂ML385，上海一研生物科技有限公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）试剂盒、肺表面活性物质蛋白⁃D（alveolar surface active substance⁃D，SP⁃D）酶联免疫吸附法（enzyme linked immunoser⁃bent assay，ELISA）试剂盒，上海江莱生物科技有限公司；兔抗大鼠Nrf2、醌氧化还原酶1［NAD（P）H：quinone oxidoreductase 1，NQO1］一抗，美国R&D公司。

Elx808 酶标仪，美国BioTek 公司；CKX41 显微镜，日本奥林巴斯株式会社；JY600 电泳仪、JY04S⁃3 凝胶成像分析系统，北京君意东方电泳设备有限公司。

1.3 新生仔鼠高氧肺损伤模型建立及干预［5-7］将雌雄SD 大鼠按1∶1 比例合笼配对，获得孕鼠7 只，共得73 只新生仔鼠，3 d 后随机分为空白组（18 只）、模型组（19 只）、Rb1 组（18 只）、Rb1 联合ML385 组（18 只）。除空白组外的各组仔鼠建立高氧肺损伤模型，将仔鼠与其母鼠分别置于玻璃氧箱内，输入氧气使氧箱内氧气浓度维持在80%，湿度维持在50%～ 70%，空白组同样置于玻璃氧箱内，输入正常空气，其余条件同其他组，保持7 d。每日开箱1 h，期间Rb1 联合ML385 组腹腔注射G⁃Rb1（10 mg/kg），10 min 后灌胃ML385 生理盐水溶液（20 mg/kg），Rb1 组腹腔注射G⁃Rb1（10 mg/kg），灌胃等量生理盐水，空白组、模型组腹腔注射等量生理盐水，灌胃等量生理盐水，每日1 次，干预7 d。干预期间，模型组、Rb1联合ML385组死亡5只仔鼠，Rb1 组死亡3 只。

1.4 组织取材干预结束后次日，各组随机选取12 只仔鼠，腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，脱颈处死，其中6 只开胸取全肺，称取肺湿重，后放入65 ℃恒温箱，干燥24 h 后取出称取干重。计算肺湿/干重比（W/D 值）=全肺湿重/全肺干重；剩余6 只暴露气管后左肺注入预冷生理盐水，行支气管肺泡灌洗术，收集肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF），4 ℃1 200 r/min离心8 min（离心半径10 cm），取其上清液，分成3 份，置于-80 ℃冰箱冷冻保存，用于后续检测；切取部分右肺组织，分成两份，一份置于4%多聚甲醛固定24 h，石蜡包埋，切片机切为4 μm 厚度连续切片用于HE 染色，一份放入-80 ℃冰箱保存，用于Western blot 实验。

1.5 BALF中MDA、SOD活性水平及SP⁃D含量检测取冷冻保存的BALF，按照试剂盒说明书要求设计实验步骤，采用硫代巴比妥酸法检测MDA 含量，羟胺法检测SOD 活性；采用酶联免疫吸附法（enzyme linked immunoserbent assay，ELISA）检测BALF 中SP⁃D 含量，根据试剂盒说明书要求设计实验步骤，酶标仪测定波长450 nm 位置吸光度值，通过标准曲线计算SP⁃D 含量。

1.6 HE 染色观察肺组织病理学变化取肺组织切片，二甲苯脱蜡，梯度酒精水洗，蒸馏水冲洗2 min，苏木精液染色5 min，蒸馏水冲洗，盐酸酒精分色，蒸馏水浸泡10 min，促蓝液蓝化，蒸馏水冲洗，伊红液复染2 min，常规脱水、透明，中性树脂封固，置于光镜下观察肺组织病理学变化，并拍照记录。

1.7 肺组织Nrf2、NQO1蛋白相对表达量检测取冷冻保存的肺组织，眼科剪剪碎，研磨器充分研磨，PBS 匀浆，加入预冷的RIPA 裂解液，置于离心管内，8 500 r/min 离心15 min（离心半径12 cm），采用BCA 法提取总蛋白并定量。取40 μg 待测样本，与5 倍体积上样缓冲液混匀，水浴加热沸腾5 min 变性蛋白，同条件离心取上清，电压80 V 行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，湿法转膜，封闭液封闭2 h，TBST洗膜，加入兔抗大鼠Nrf2、NQO1一抗（工作浓度1∶500），4 ℃摇床孵育过夜，TBST 洗膜，加入二抗（工作浓度1∶2 000），常温孵育2 h，ECL显色，暗室曝光，经凝胶成像系统拍照分析，蛋白表达量为条带灰度值/内参GAPDH 条带灰度值。

1.8 统计学方法采用IBM SPSS 20.0 统计学软件分析数据，计量资料以均数±标准差表示，方差分析检验多样本计量资料，以t检验行两样本比较。P<0.05 差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组仔鼠肺W/D 值比较空白组、模型组、Rb1 组、Rb1 联合ML385 组新生仔鼠肺W/D 值分别为（4.97 ± 0.52）、（5.87 ± 0.61）、（5.19 ± 0.54）、（5.38 ± 0.56），与空白组比较，模型组肺W/D 值升高（P< 0.05）；与模型组比较，Rb1 组肺W/D 值降低（P<0.05）；与Rb1 组比较，Rb1 联合ML385 组肺W/D 值升高（P<0.05）。

2.2 各组仔鼠BALF 中MDA、SOD 活性水平比较与空白组比较，模型组MDA 水平升高，SOD活性降低（P< 0.05）；与模型组比较，Rb1 组肺MDA 水平降低，SOD 活性升高（P< 0.05）；与Rb1组比较，Rb1 联合ML385 组水平升高，SOD 活性降低（P<0.05）。见表1。

表1 各组BALF 中MDA、SOD 活性水平比较Tab.1 Comparison of MDA and SOD activity levels of BALF in each group ±s

表1 各组BALF 中MDA、SOD 活性水平比较Tab.1 Comparison of MDA and SOD activity levels of BALF in each group ±s

注：与空白组比较，aP < 0.05；与模型组比较，bP < 0.05；与Rb1组比较，cP<0.05

组别空白组模型组Rb1 组Rb1 联合ML385 组F 值P 值例数6 6 6 6 MDA（nmol/mg）0.31±0.04 0.78±0.09a 0.50±0.07b 0.62±0.07c 48.359<0.001 SOD（UN/mg）8.59±1.27 5.86±0.69a 7.71±0.88b 6.20±0.75c 11.534<0.001

2.3 各组仔鼠SP⁃D 水平比较空白组、模型组、Rb1 组、Rb1 联合ML385 组新生仔鼠SP⁃D 含量分别为（2.58 ± 0.26）ng/L、（4.71 ± 0.50）ng/L、（3.04 ±0.31）ng/L、（4.12 ± 0.43）ng/L，与空白组比较，模型组SP⁃D 水平升高（P< 0.05）；与模型组比较，Rb1组SP⁃D 水平降低（P< 0.05）；与Rb1 组比较，Rb1联合ML385 组SP⁃D 水平升高（P<0.05）。

2.4 各组仔鼠肺组织病理学变化HE 染色结果显示，空白组肺组织完整，肺泡结构清晰，无病理学变化；模型组肺组织结构破坏严重，肺泡间距增加，可见大量炎性细胞浸润；Rb1 组和Rb1 联合ML385 组肺组织结构异常，肺泡间距增加较少，炎性细胞数量浸润程度均低于模型组，Rb1 组比Rb1联合ML385 组病理改善更明显。见图1。

图1 HE 染色观察各组肺组织病理变化（×200，标尺50 μm）Fig.1 HE staining to observe the pathological changes of lung tissues in each group（×200，scale 50 μm）

2.5 各组仔鼠肺组织Nrf2、NQO1 蛋白表达量比较与空白组比较，模型组Nrf2、NQO1 蛋白表达量升高（P< 0.05）；与模型组比较，Rb1 组肺Nrf2、NQO1 蛋白表达量升高（P< 0.05）；与Rb1 组比较，Rb1 联合ML385 组Nrf2、NQO1 蛋白表达量降低（P<0.05）。见表2、图2。

图2 各组仔鼠肺组织Nrf2、NQO1 蛋白表达Fig.2 Expression of Nrf2 and NQO1 protein in the lung tissues of offspring in each group

表2 各组肺组织Nrf2、NQO1 蛋白表达量比较Tab.2 Comparison of Nrf2 and NQO1 protein expression of lung tissues in each group ±s

表2 各组肺组织Nrf2、NQO1 蛋白表达量比较Tab.2 Comparison of Nrf2 and NQO1 protein expression of lung tissues in each group ±s

注：与空白组比较，aP < 0.05；与模型组比较，bP < 0.05；与Rb1组比较，cP<0.05

组别空白组模型组Rb1 组Rb1 联合ML385 组F 值P 值例数6 6 6 6 MDA（nmol/mg）0.31±0.04 0.78±0.09a 0.50±0.07b 0.62±0.07c 48.359<0.001 SOD（UN/mg）8.59±1.27 5.86±0.69a 7.71±0.88b 6.20±0.75c 11.534<0.001

3 讨论

高氧肺损伤以肺泡上皮细胞、毛细血管内皮细胞损伤为主要病理改变，表现为进行性呼吸窘迫、低氧血症，威胁患儿生命健康［8］。目前新生儿高氧肺损伤的发病机制尚未被完全阐明，一般认为与氧化应激反应、免疫细胞异常活化、肺表面活性物质改变、炎性细胞因子增多、毛细血管屏障破坏、细胞凋亡等因素有关，其中氧化应激反应机制被大多数人所认同［9］。由于新生儿肺发育不全、抗氧化酶活性低，导致抗氧化系统超负荷，打破氧化⁃抗氧化动态平衡，肺组织氧自由基过量，造成氧中毒，直接损伤肺组织细胞，引起炎症反应，招募并激活免疫细胞，进一步损伤肺组织［10］。

新生SD 仔鼠在免疫反应、病理生理及组织发育等方面与新生儿相似性很强，采用该仔鼠建立高氧肺损伤模型，并在该基础上进行实验研究可行性与科学性较强。肺W/D 值是肺部水肿程度的直接指标，可反映肺损伤程度，肺损伤后大量液体渗出转移至肺间质，肺湿重增大，W/D 值升高［11-12］。MDA 是机体内自由基与细胞脂质膜的过氧化产物，具有细胞毒性，可诱导蛋白质、核酸、脂质等物质交联，破坏生物膜，其水平可反映机体氧化应激反应严重程度，SOD 是氧自由基清除酶，广泛分布于机体代谢器官组织，可维持机体氧化⁃抗氧化动态平衡，其活性水平可反应机体抗氧化能力［13］。SP⁃D 是一种大分子表面活性蛋白，作为肺部重要的免疫调节剂，在免疫防御过程中发挥重要作用，其可识别并结合微生物、非微生物颗粒或坏死细胞，提升免疫细胞的吞噬能力及杀伤力，又可间接调控促炎因子，保护肺损伤，可作为高氧肺损伤的生物标记物［14］。人参是我国名贵中药材，取自五加科植物人参的干燥根，性温，味甘、微苦、微温，归脾，肺经，可补气固脱、补脾益肺、安益智神，张元素所著《医学启源》记载，可治肺气促，短气、少气，补中缓中，泻肺脾胃中火邪［15］。G⁃Rb1 是人参主要活性成分之一，可提升神经系统兴奋性，改善心肌功能，增强机体抵抗力。SHAUKAT 等［16］研究认为，G⁃Rb1 可缓解过度炎症导致急性呼吸窘迫综合征，从而对金黄色葡萄球菌诱导的急性肺损伤小鼠产生治疗作用，提示G⁃Rb1 在肺部疾病中的作用。本研究结果显示，与模型组比较，Rb1 组肺W/D 值、MDA 水平、SP⁃D 水平降低，SOD 活性升高，提示G⁃Rb1 可改善新生仔鼠肺损伤，提升机体抗氧化能力。

Nrf2/ARE 信号通路是机体重要的抗氧化应激信号通路，在多种疾病的氧化⁃抗氧化动态平衡调节过程中扮演重要角色，其中Nrf2 是CNC 调节蛋白家族成员，是一种高度保守的转录因子，ARE 是机体重要的抗氧化反应驱动序列，可被多种氧化性物质激活，启动抗氧化酶转录，NQO1 是Nrf2 下游抗氧化靶蛋白，可降解毒性化合物，抑制其参与氧化还原反应［17-18］。机体正常状态下，Nrf2 与Kelch 样环氧氯丙烷相关蛋白1（Kelch⁃like ECH⁃associated protein 1，Keap1）结合低表达于胞质中，当受到氧自由基刺激后，Nrf2 表达升高并与Keap1分离，转移至胞核与ARE 序列结合，激活Nrf2/ARE信号通路，启动多个下游基因如NQO1 转录，大量释放抗氧化酶，不同因子相互作用进一步提升机体抗氧化能力［19-20］。LIAN 等［21］研究认为，激活Nrf2/ARE 通路可减轻间歇性缺氧诱导的肺损伤，从而治疗阻塞性睡眠呼吸暂停大鼠，提示Nrf2/ARE 通路对肺部的保护作用。本研究结果显示，与模型组比较，Rb1 组肺Nrf2、NQO1 蛋白表达量升高，且在G⁃Rb1 基础上增用Nrf2/ARE 通路抑制剂ML385 可减弱G⁃Rb1对高氧肺损伤的改善作用，提示可能通过介导该通路，抑制肺组织氧化应激反应，从而对高氧肺损伤新生仔鼠产生保护作用。目前关于G⁃Rb1 毒理学安全性的系统研究尚少，尽管天然食物及传统中草药成分常规食用是安全的，但其有效成分经过现代科学技术提炼、浓缩后的安全资料相对缺乏。田辉等［22］在观察人参皂甙的安全性时发现，其符合特殊食品安全毒理学要求。但有学者认为［23］，暴露于50 μg/mL 的胚胎与未暴露的胚胎相比具有显著较低的中位形态学评分，提示其具有一定的胚胎毒性。但因其应用时间较短且较少应用于临床，安全性仍有待长期观察，尤其应加强对其应用于妊娠患者中的安全性的关注。

综上所述，G⁃Rb1 可改善新生仔鼠肺损伤，提升机体抗氧化能力，抑制肺组织氧化应激反应，激活Nrf2/ARE 通路可能是其发挥作用的机制之一。然而，G⁃Rb1 对肺损伤的治疗可能通过多条通路发挥作用，在后续实验中需进一步研究。