阿魏酸钠调控JAK2/STAT3信号通路对胶质瘤细胞增殖、侵袭、凋亡的影响

2022-02-22赵海林胡骕彭彪罗冬冬李丹

实用医学杂志 2022年2期

赵海林胡骕彭彪罗冬冬李丹

广州医科大学附属肿瘤医院神经外科（广州510095）

胶质瘤属于一种较为常见的颅内恶性肿瘤，恶性程度较高，临床发病率、预后死亡率均处于较高的水平，就目前现有的医疗水平而言，尚无治疗方法，多采用早期手术、放化疗手段治疗，但部分患者经临床常规治疗后患者3年生存率仍较低［1-3］。因此积极寻找有效治疗胶质瘤的药物对延长胶质瘤患者生存周期具有重要意义。阿魏酸钠属于一种非肽类内皮素受体拮抗剂，是阿魏酸的一种钠盐，其目前主要应用于肾脏疾病、糖尿病、心脑血管疾病的治疗中，但近年来有报道称其具有抗肿瘤作用［4-5］。有研究显示［6］，阿魏酸钠可以增加人EBL⁃7404 肝癌细胞的凋亡、抑制其生存性。基于此，本次主要研究使用阿魏酸钠对胶质瘤细胞进行体外培养，分析其对胶质瘤细胞生物学行为的影响，以明确其是否具有抗肿瘤作用，为临床上胶质瘤的药物治疗提供新方向。

1 材料与方法

1.1 研究细胞及试剂来源胶质瘤细胞系U251由上海雅吉生物科技有限公司提供。试剂来源：阿魏酸钠（成都亨达药业有限公司）；环磷酰胺（深圳海思安生物技术有限公司）；MTT 试剂（上海抚生实业有限公司）；胎牛血清［汉恒生物工程（上海）有限公司］；DMEM 培养基（武汉益普生物科技有限公司）；磷酸盐缓冲液（上海广锐生物科技有限公司）；小鼠抗大鼠p⁃JAK2 抗体、兔抗大鼠p⁃STAT3抗体（武汉菲恩生物科技有限公司）。本次研究获得我院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养取所购买的胶质瘤细胞系U251，使用第3～ 9 代的细胞按照1∶4 的比例做传代培养，加入15 mL含10%胎牛血清的DMEM培养基中，在37 ℃、2.5%CO2的培养箱中进行培养，待细胞生长大约为90%时，使用含0.1%胎牛血清的DMEM培养基阻断24 h，用于后续实验。

1.2.2 阿魏酸钠的LC50及实验分组、最佳有效时间测定取所培养的细胞，采用MTT 法测定阿魏酸钠在1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6mg/mL 各浓度下对细胞的抑制率，设定量效关系曲线，计算阿魏酸钠的LC50，确定阿魏酸钠的低、中、高浓度，分别作为低浓度组、中浓度组、高浓度组。

1.2.3 阿魏酸钠干预将细胞分为常规培养的空白组、使用环磷酰胺（30 μmol/L）培养的阳性对照组，高浓度组、中浓度组、低浓度组分别使用0.3、0.03、0.003 mg/mL 阿魏酸钠培养。在培养72 h 后观察细胞生物学行为。

1.2.4 细胞增殖检测采用MTT 法测定细胞增殖情况，取各组细胞，将细胞浓度调整为3×104个/mL，将200 μL 细胞悬液接种于96 孔板上，在37 ℃、5% CO2环境下培养72 h，加入10 μL MTT 试剂，孵育4 h，计算细胞增殖率，使用酶标仪检测波长为570 mm 细胞的OD值。重复检测3 次取均值，细胞增殖率=（细胞组OD值/对照组OD值）×100%。

1.2.5 细胞凋亡检测采用TUNEL 法测定细胞凋亡情况，在荧光显微镜下做细胞凋亡计数，根据洗涤、DAPI 染色封片后细胞核颜色情况判定细胞凋亡情况，细胞核为绿色荧光表示阳性，细胞核为蓝色荧光表示阴性，重复检测3 次取均值。细胞凋亡率=阳性细胞数/总细胞数×100%。

1.2.6 细胞迁移检测细胞迁移能力使用划痕实验测定，取所培养的细胞在18 孔板上接种，待细胞生长至80%时，使用枪头（100 μL）做垂直划直线操作，之后使用磷酸盐缓冲液洗涤3 次，加入血清培养基（0.5%），72 h 后使用倒置显微镜观察细胞迁移情况。迁移率=（0 h 细胞间距-观察时间细胞间距）/0 h 细胞间距。每次重复测量5 次，取均值。

1.2.7 细胞侵袭检测细胞侵袭能力使用Tran⁃swell 小室（美国Corning 公司）测定，苏木晶染色、PBS 清洗，使用倒置显微镜观察5 个不同视野细胞侵袭情况，做细胞侵袭计数，细胞侵袭计数为每个视野的穿模细胞数。每次重复测量5 次，取均值。

1.2.8 JAK2/STAT3 通路蛋白表达检测细胞JAK2/STAT3 通路蛋白p⁃JAK2、p⁃STAT3 表达情况使用Western blot 法测定，对所培养的细胞做离心、蛋白提取，提取完成后使用BCA 做蛋白定量测定，将所提取的50 μg 蛋白加入至2×SDS 凝胶缓冲液中，做电泳、转膜、取膜、固定、封闭处理，将1∶1 000 比例的TBST 稀释的p⁃JAK2、p⁃STAT3 一抗，在温度为4 ℃的环境下孵育过夜，TBST 重复做3 次洗膜处理，加入1∶10 000 TBST 稀释的二抗，摇动孵育60 min，TBST 重复做3 次洗膜处理，使用DAB做显色处理，分析蛋白表达情况。以GAPDH 蛋白为内参。

1.3 统计学方法采用SPSS 26.0 软件进行分析。计量资料采用均数±标准差表示，多组间比较采用方差齐性检验，两组间比较采用独立样本t检验，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 阿魏酸钠的LC50 及实验分组测定结果如表1所示，MTT 检测发现，阿魏酸钠在1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6mg/mL 各浓度下对细胞的抑制率逐渐降低，经计算其LC50=0.307 5 mg/mL，绘制量效关系曲线发现，在1～ 10-3mg/mL 对细胞增殖的抑制较为明显，结合药物的LC50，设定本次研究的阿魏酸钠高、中、低浓度分别为0.3、0.03、0.003 mg/mL，分别作为低浓度组、中浓度组、高浓度组，见图1。

图1 阿魏酸钠量效关系曲线Fig.1 The dose⁃effect relationship curve of sodium ferulate

表1 阿魏酸钠对胶质瘤细胞增殖的影响Tab.1 The effect of sodium ferulate on the proliferation of glioma cells±s

阿魏酸钠浓度（mg/mL）1 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 OD 值0.19±0.02 0.23±0.04 0.33±0.03 0.40±0.03 0.41±0.02 0.42±0.03 0.43±0.05抑制率（%）78.65 65.26 22.35 15.63 4.62 5.33 5.62

2.2 阿魏酸钠对胶质瘤细胞增殖、凋亡的影响与空白组相比，阳性对照组、低、中、高浓度组增殖率降低，凋亡率升高；与阳性对照组相比，低、中、高浓度组增殖率降低，凋亡率升高（P< 0.05）；与低浓度组相比，中、高浓度组增殖率降低，凋亡率升高（P< 0.05）；与中浓度组相比，高浓度组增殖率降低，凋亡率升高（P<0.05）。见表2。

表2 阿魏酸钠对胶质瘤细胞增殖、凋亡的影响Tab.2 The effect of sodium ferulate on the proliferation and apoptosis of glioma cells±s，%

注：与空白组相比，aP < 0.05；与阳性对照组相比，bP < 0.05；与低浓度组相比，cP<0.05；与中浓度组相比，dP<0.05

组别空白组阳性对照组低浓度组中浓度组高浓度组F 值P 值细胞增殖率42.35±5.59 30.16±3.39a 21.03±2.16ab 10.35±1.33abc 2.67±0.24abcd 33.640 0.001细胞凋亡率10.13±1.02 22.35±2.06a 42.26±4.15ab 61.13±6.33abc 78.25±7.16abcd 44.678 0.001

2.3 阿魏酸钠对胶质瘤细胞侵袭、迁移的影响与空白组相比，阳性对照组、低、中、高浓度组侵袭数、迁移率降低（P< 0.05）；与阳性对照组相比，低、中、高浓度组侵袭数、迁移率降低（P< 0.05）；与低浓度组相比，中、高浓度组侵袭数、迁移率降低（P<0.05）；与中浓度组相比，高浓度组侵袭数、迁移率降低（P<0.05）。见表3。

表3 阿魏酸钠对胶质瘤细胞侵袭、迁移的影响Tab.3 The effect of sodium ferulate on the invasion and migration of glioma cells±s

注：与空白组相比，aP < 0.05；与阳性对照组相比，bP < 0.05；与低浓度组相比，cP<0.05；与中浓度组相比，dP<0.05

组别空白组阳性对照组低浓度组中浓度组高浓度组F 值P 值细胞侵袭数（个）1 795.68±142.26 1 023.35±104.25a 762.35±78.96ab 425.66±46.35abc 215.26±20.34abcd 52.166 0.001细胞迁移率（%）68.59±7.46 48.65±3.35a 22.19±2.00ab 16.35±1.62abc 5.13±0.37abcd 40.301 0.001

2.4 阿魏酸钠对胶质瘤细胞中JAK2/STAT3 通路蛋白表达的影响与空白组相比，阳性对照组、低、中、高浓度组p⁃JAK2、p⁃STAT3 蛋白表达量降低（P< 0.05）；与阳性对照组相比，低、中、高浓度组p⁃JAK2、p⁃STAT3 蛋白表达量降低（P<0.05）；与低浓度组相比，中、高浓度组p⁃JAK2、p⁃STAT3 蛋白表达量降低（P<0.05）；与中浓度组相比，高浓度组p⁃JAK2、p⁃STAT3 蛋白表达量降低（P< 0.05）。见表4、图2。

表4 阿魏酸钠对胶质瘤细胞中JAK2/STAT3 通路蛋白表达的影响Tab.4 The effect of sodium ferulate on the expression of JAK2/STAT3 pathway protein in glioma cells±s

注：与空白组相比，aP < 0.05；与阳性对照组相比，bP < 0.05；与低浓度组相比，cP<0.05；与中浓度组相比，dP<0.05

组别空白组阳性对照组低浓度组中浓度组高浓度组F 值P 值p⁃JAK2 1.06±0.25 0.76±0.08a 0.44±0.06ab 0.35±0.05abc 0.12±0.02abcd 17.778 0.001 p⁃STAT3 1.33±0.16 1.02±0.10a 0.81±0.07ab 0.50±0.05abc 0.26±0.04abcd 30.774 0.001

图2 JAK2/STAT3 通路蛋白Western Blot 图Fig.2 Western blot map of JAK2/STAT3 pathway protein

3 讨论

胶质瘤恶性程度较高，患者大多预后不良，因此有效的治疗手段对控制患者疾病发展、改善具有重要的意义［7］。阿魏酸钠是从当归或川芎中提取的水溶性有效成分，对多种肿瘤具有治疗效果［8］。因此，本研究旨在研究阿魏酸钠通过调控JAK2/STAT3信号通路对胶质瘤细胞增殖、侵袭、凋亡的影响。

目前已有许多研究发现，阿魏酸具有较强的抗癌活性，如抑制宫颈癌裸鼠移植瘤生长［9］、人肝癌HepG2 细胞凋亡［10］、诱导食管癌细胞周期阻滞和自噬［11］以及调控乳腺癌细胞生物学行为［12］等。阿魏酸钠是阿魏酸的一种钠盐，其作用与阿魏酸作用一致。因此笔者推测，阿魏酸钠可能具有抑制胶质瘤细胞增殖、迁移、侵袭，促进凋亡的作用，本研究中选取胶质瘤细胞，使用不同浓度的阿魏酸钠进行培养，分析其对胶质瘤细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡的影响，结果发现，与使用环磷酰胺培养的细胞相比，使用阿魏酸钠培养的细胞增殖、迁移、侵袭能力明显被抑制，且明显促进细胞凋亡，此结果提示着，阿魏酸钠具有一定的抗胶质瘤作用。阿魏酸属酚酸的一种，其广泛存在于植物中，具有较强的抗氧化性、抗炎、抗菌、防心血管疾病以及抗癌作用等，近年来在临床上被认为属于一种抗癌物质［13］。阿魏酸钠具有抗氧化、抗血小板聚集、神经保护、增强免疫功能等，影响着胶质瘤细胞的生物学行为［14-15］。

近年来随着对此信号通路的不断深入研究发现，其在恶性肿瘤中具有促进过程，在细胞癌变过程中，JAK2/STAT3 通路中的JAK2 磷酸化，其在磷酸化水平上可激活STAT3 表达，进而诱导恶性肿瘤细胞异常增殖，最终促使疾病进一步恶化，危及生命［16-18］。有研究表明［19］，JAK2/STAT3 通路可以抑制的炎性介质释放，有效地减轻肝硬化大鼠肝脏缺血再灌注损伤。有研究发现［20］，通过抑制JAK2/STAT3信号通路活化，可以抑制胶质瘤细胞上皮⁃间质转，从而影响到胶质瘤。有研究发现［21］，JAK2/STAT3信号通路的激活影响着胶质瘤细胞的恶性生物学行为，影响着细胞的增殖、凋亡。有研究发现［22］，阻断JAK2/STAT3信号通路促使胶质瘤细胞增加，凋亡减少，细胞增殖率、迁移率较低，影响胶质瘤的恢复。本文研究结果显示，经阿魏酸钠干预后细胞中JAK2/STAT3 通路JAK2 磷酸化和STAT3 表达明显被抑制，且呈剂量依赖，此结果提示着，阿魏酸钠可能经促使此信号通路失活而发挥抗胶质瘤的作用。分析原因：JAK2/STAT3信号通路参与神经元分化、增殖、炎症反应等在机体多种病理过程［23］。JAK2/STAT3 通路在胶质瘤发生发展过程中具有明显的促进作用，经抑制此信号通路活性可发挥抗胶质瘤的作用［24-25］。

综上所述，阿魏酸钠可能通过JAK2/STAT3 通路作用于胶质瘤，促使此通路失活而发挥抑制胶质瘤细胞增殖、迁移、侵袭，促进凋亡的作用。但是，本文研究样本较少，还需进一步的研究。