miR⁃26b⁃5p通过靶向NFE2L3调控结直肠癌细胞生长、迁移和侵袭

黄波 李慧雯 常诚

1广州市红十字会医院普外科（广州510220）；2广州市妇女儿童医疗中心消化内科（广州510623）

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是常见的结直肠系统恶性肿瘤之一，恶性程度排第三，死亡率排第二，全球每年新增患者约185 万例，死亡病例约88 万［1］。我国结直肠癌的发病率和死亡率近十年呈上升趋势［2］。阐明结直肠癌发生发展的分子机制，寻找临床诊断标志物及治疗靶点，具有重要意义。转录因子（NF⁃E2）相关因子3（NFE2L3，Nrf3）是NF⁃E2 家族成员，在抗氧化作用的表达调控上发挥重要作用。NFE2L3 与乳腺癌等多种恶性肿瘤相关［3-4］，但其在结直肠癌中的作用及其分子调控机制目前未见明确报道。MicroRNA（miRNA）是一类长度约20～25 个核苷酸的非编码RNA，高度保守，其通过与靶向基因mRNA 的3′端非翻译区（3′ untranslational region，3′ UTR）互补，从而导致靶向基因mRNA 降解，从而抑制靶基因的翻译表达［5-6］。越来越多的证据表明，miRNA 参与了结直肠癌的发生发展过程［7-10］。前期笔者通过生物信息学分析预测发现，miR⁃26b⁃5p 在NFE2L3 mRNA 的3′ UTR 区存在一个潜在的靶向位点，提示miR⁃26b⁃5p 可能调控NFE2L3 蛋白水平，参与结直肠癌的生物新过程，相关研究未见报道。因此，本研究旨在探讨miR⁃26b⁃5p 调控NFE2L3 在结直肠癌中的作用及其具体分子机制，分析该信号轴对结直肠癌细胞生长、迁移和侵袭能力的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料及来源人正常肠上皮细胞（NCM460）及结直肠癌细胞系（HT29、SW620 及HCT116）购自中国科学院上海细胞库；细胞培养用胎牛血清，DMEM 培养液购自美国Gibco 公司；TRIzol、总RNA提取试剂盒，Lippofectamine2000 购自美国Invitro⁃gen 公司；RIPA 裂解液、BCA 定量试剂盒等购自中国碧云天；抗NFE2L3 和GAPDH 购自美国Sigma 公司；Transwell 小室购自美国Corning 公司；双荧光素酶报道基因试剂盒购自美国Promega 公司。miR⁃26b⁃5p 的引物、mimics 由上海生工合成。NFE2L3质粒构建：通过PCR 调取NFE2L3 的全长编码区。回收PCR 扩增产物，酶切连接到pEGFP⁃C1 质粒中，通过测序确定连接成功。

1.2 细胞培养和转染细胞系在10%胎牛血清和1%青链霉素混合的DMEM培养基中，37 ℃，5%CO2的培养箱中培养。通过转染试剂盒对结直肠癌细胞系进行转染，将miR⁃26b⁃5p 对照或者mimic 片段，或与NFE2L3 过表达质粒混合以共转染。转染24 h 后观察荧光，确认转染效率。转染方法按照Lipofectamine 2000 的说明书进行。

1.3 RT⁃qPCR 检测细胞的总RNA 经由Trizol 法提取，与液氮中保存。使用逆转录试剂盒进行逆转录反应合成互补脱氧核糖核酸（cDNA），然后加入SYBR green进行PCR扩增。引物信息如下：miR⁃26b⁃5p上下游引物：5′⁃GGGGTTCAAGTAATTCAGG⁃3′和5′⁃CAGTGCGTGTCGTGGAGT⁃3′；NFE2L3 的上下游引物：5′⁃CTGACTGGGAAGGCAGAAAAG⁃3′和5′⁃TCAGGCTGTGATGAAAGCAA⁃3′；U6 的上下游引物分别为：5′⁃TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC⁃3′和5′⁃CCAGTGCAGGGTCCGAGGT⁃3′；Actin 的上下游引物分别为：5′⁃CCAACCGCGAGAAGAT⁃3′和5′⁃CCAGAGGCGTACAGGG⁃3′。

1.4 Western blot 实验各组细胞经RIPA 裂解液裂解变性后采用BCA 法进行蛋白定量，然后取上清进行蛋白上样。按照Western blotting 实验的常规步骤进行上样、电泳、转膜、封闭、孵育一抗二抗、显影曝光。X 光片经扫描后采用ImageJ 进行条带灰度的分析，以目的条带与内参GAPDH 的灰度比值表示NFE2L3 的相对含量。

1.5 CCK⁃8 实验按1∶10 的比例在基础培养基中加入CCK⁃8，配置成工作液，而后对处理后细胞进行换液，1～ 4 h 后测定A450 的值，记为day 0 的初始值。分别于转染后day 1，day 2 和day 3 进行收样并测定A450 的值，绘制细胞生长曲线，观察细胞增殖情况。

1.6 Transwell 实验细胞进行转染处理24 h 后，通过胰酶消化进行无血清培养基重悬，调整细胞密度，取细胞悬液200 μL，加在Transwell 小室的上层，小室下层加入500 μL 含10%胎牛血清的完全培养基，而后置于孵箱继续培养48 h 后取出小室，PBS 清洗后擦去上室残留细胞，4%多聚甲醛固定，然后用结晶紫染色，随机取5 个视野，进行染色细胞计数。对于侵袭实验，Transwell 上室预先铺设matrigel 基质胶。

1.7 双荧光素酶报道基因实验取对数生长期的细胞接种于96 孔板中，通过脂质体转染试剂盒，将Renilla 荧光素酶报道基因和miR⁃26b⁃5p mimic片段进行共转染。继续培养48 h 后，检测海参荧光素酶的发光强度与萤火虫荧光素酶发光强度。

1.8 克隆形成实验细胞胰酶消化后接种5 000个细胞到6 孔培养板中，于培养箱中培养2 周。镜下观察出现肉眼可见的细胞克隆时，终止培养，弃去培养液清洗后用4%多聚甲醇固定15 min，然后进行结晶紫染色。镜下拍照并计数相对克隆形成数量。

1.9 流式细胞术各组细胞转染后，经0.25%的胰酶消化，然后转至1.5 mL EP管离心（4 ℃、1 000 r/min、5 min）收集细胞，加入结合缓冲液悬浮细胞，然后加入5 μL Annexin Ⅴ⁃FITC 和5 μL PI，15 min 后用BD⁃FACSCalibur 进行流式细胞术分析。

1.10 统计学方法所有实验数据录入GraphPad Prism 9.0.0 进行统计分析。所有实验均重复3 次，计量资料采用均数±标准差表示。两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR⁃26b⁃5p 和NEF2L3 在结直肠癌细胞系中的表达培养了人正常肠上皮细胞（NCM460）及结直肠癌细胞系（HT29、SW620 及HCT116），并通过qRT⁃PCR 检测了miR⁃26b⁃5p 的水平。结果如图1A所示，miR⁃26b⁃5p的表达水平在结直肠癌细胞系中中显著低于正常肠上皮细胞（均P<0.05）。同样进行了NEF2L3 在上述细胞系的检测，qRT⁃PCR 的结果显示（图1B），NEF2L3 的mRNA 水平在结直肠癌细胞系的水平均高于正常肠上皮细胞（均P<0.05）。而western blotting 的结果显示（图1C），NEF2L3 的蛋白水平也存在同样的趋势，在癌细胞系中显著上调，统计结果见图1D（均P< 0.05）。这些结果表明，miR⁃26b⁃5p 在结直肠癌细胞系中下调，而NEF2L3 的mRNA 和蛋白水平则上调。

进一步构建了NEF2L3表达质粒，并在HT29细胞中过表达。CCK⁃8 的结果表明，过表达NEF2L3可显著促进癌细胞生长（图1E）；Transwell 实验表明，过表达NEF2L3 可显著促进癌细胞迁移和侵袭（图1F）。

图1 miR⁃26b⁃5p 和NEF2L3 在结直肠癌细胞系中的表达水平Fig.1 Expression levels of miR⁃26b⁃5p and NEF2L3 in colorectal cell lines

2.2 miR⁃26b⁃5p 靶向调控NEF2L3前面的结果提示miR⁃26b⁃5p 和NEF2L3 的表达水平在结直肠癌细胞系中呈现反向关系，而miRNA及其下游底物大多数为负向调控，提示miR⁃26b⁃5p 和NEF2L3 存在靶向关系。通过TargetScan在线数据库进行生物信息学分析，发现NEF2L3 的3′UTR 区域上确实存在能与miR⁃26b⁃5p 匹配的序列（图2A），而且该序列在人、大鼠和小鼠的NEF2L3 的3′ UTR 区域上均保守。为此，笔者合成了miR⁃26b⁃5p 的mimic 片段，并构建了含NEF2L3 3′UTR 靶向序列的荧光素酶报道基因质粒。见图2B，荧光素酶报道基因的实验结果显示，过表达miR⁃26b⁃5p 的mimic 片段可以显著抑制NEF2L3 的野生型（NEF2L3 WT）信号（P< 0.05），但对其突变质粒（NEF2L3 MUT）则无效。RT⁃qPCR 的结果表明，过表达mimic 可显著抑制NEF2L3 mRNA水平（图2C）；而Western blot 的结果表明，过表达mimic 可显著抑制NEF2L3 的蛋白水平（图2D）。这些结果提示，miR⁃26b⁃5p 可直接靶向调控NEF2L3。

图2 双荧光素酶报道基因实验验证NEF2L3 作为miR⁃26b⁃5p 的靶基因。Fig.2 The dual luciferase reporter gene experiment verified NEF2L3 as the target gene of miR⁃26b⁃5p

2.3 miR⁃26b⁃5p/NEF2L3 信号调控结直肠癌细胞增殖和克隆形成选取两株结直肠癌细胞系HT29和SW620进行功能研究。在两株细胞系中转染了miR⁃26b⁃5p 及其对照片段、共转了NEF2L3 过表达质粒及对照进行拮抗实验。Western blot 的结果验证了各组对NEF2L3 蛋白的影响（图3A⁃B）。CCK⁃8 实验表明过表达miR⁃26b⁃5p 可抑制结两株直肠癌细胞的生长（图3C⁃D，均P< 0.05），而共表达NEF2L3 则可抵消miR⁃26b⁃5p 的抑制作用，细胞生长恢复到正常水平（均P< 0.05）。同样的克隆形成实验结果表明，miR⁃26b⁃5p 可抑制结直肠癌细胞克隆的形成，而共表达NEF2L3 则可抵消miR⁃26b⁃5p 的抑制作用，癌细胞克隆形成能力恢复（均P<0.05，图3E⁃F）。

图3 共转染NEF2L3 和miR⁃26b⁃5p 对结直肠癌细胞生长和细胞克隆形成能力的影响Fig.3 The effect of co⁃transfection of NEF2L3 and miR⁃26b⁃5p on the growth and cloning formation of colorectal cancer cells

2.4 miR⁃26b⁃5p/NEF2L3 信号调控结直肠癌细胞凋亡通过流式细胞术观察miR⁃26b⁃5p/NEF2L3信号对结直肠癌细胞凋亡的影响。见图4A，过表达miR⁃26b⁃5p mimic 显著促进HT29 及SW620 细胞的凋亡，而过表达NEF2L3 可显著削弱其引起细胞凋亡的作用（均P<0.05，图4B）。

图4 共转染NEF2L3 和miR⁃26b⁃5p 对结直肠癌细胞凋亡能力的影响Fig.4 The effect of co⁃transfection of NEF2L3 and miR⁃26b⁃5p on the apoptosis of colorectal cancer cells

2.5 miR⁃26b⁃5p/NEF2L3 信号调控结直肠癌细胞增迁移和侵袭见图5A，miR⁃26b⁃5p 可显著抑制HT29 及SW620 细胞的迁移能力，NEF2L3 可显著减弱miR⁃26b⁃5p 的抑制作用，使癌细胞迁移能力恢复（均P< 0.05，图5A）。同样的，对于结直肠癌细胞的侵袭能力，miR⁃26b⁃5p 及NEF2L3 存在相同的调控趋势（均P< 0.05，图5B）。结合前面的结果，表明miR⁃26b⁃5p 可通过靶向调控NEF2L3，影响结直肠癌细胞的生长、克隆形成、细胞迁移和侵袭。

图5 共转染NEF2L3 和miR⁃26b⁃5p 对结直肠癌细胞迁移和侵袭能力的影响Fig.5 The effect of co⁃transfection of NEF2L3 and miR⁃26b⁃5p on the migration and invasion of colorectal cancer cells

3 讨论

miRNAs 具有广泛的基因调节功能，参与肿瘤发生发展的多个环节，扮演着重要角色［6，11-13］。研究表明，miRNA 的表达调节失衡与结直肠癌的发生和转移及恶性表型密切相关［14-15］。

肿瘤组织和外周血中存在miR⁃26 的异常表达，且在多种类型的实体瘤组织中可以检测到miR⁃26a/b 的低表达。通过miRNA 表达谱和qPCR测定，JI 等［16］测量了455 个肝癌组织中miR⁃26a/b的表达，发现miR⁃26a/b 在肝细胞癌（HCC）组织中的表达显著低于邻近正常组织，肝癌组织中miR⁃26a/b 低表达的患者总生存期较短，但对干扰素α（IFN⁃α）治疗反应较好。且IFN⁃α 治疗可提高miR⁃26 低表达的HCC 患者后的总生存率［17］。此外，miR⁃26 家族在食管癌组织中的低表达［18］，并且miR⁃26a 的低表达与食管腺癌的发生和转移密切相关［19］。在胃癌组织中也可检测到miR⁃26a 水平降低，与miR⁃26a 高表达患者相比，miR⁃26a低表达患者的中位OS时间和无复发生存时间（RFS）更短［20］。ZHANG等［21］报道，乳腺癌组织中miR⁃26a的表达明显低于肿瘤邻近的正常组织，这与患者的年龄和肿瘤组织中HER2的表达有关。miR⁃26b 的低表达与乳腺癌患者较短的无远处转移生存期和总生存期相关［22］。miR⁃26 在某些肿瘤里面高表达。比如KIM 等［23］报道，胶质母细胞瘤组织中miR⁃26a 的表达增加，且miR⁃26a 高表达的患者生存时间缩短。miR⁃26a⁃2 在脂肪肉瘤肿瘤组织中也高表达，miR⁃26a⁃2 的高表达与脂肪肉瘤患者的预后呈负相关［24］。LAUREN等［25］报道miR⁃26a在结直肠癌样本中低表达，且miR⁃26a通过调节PTEN参与结直肠癌的发生发展。我们的研究表明，miR⁃26b⁃5p 在结直肠癌细胞系中低表达，进一步的功能实验表明miR⁃26b⁃5p 能够通过下游靶基因调控结直肠癌细胞系的生长、增殖、凋亡、迁移和侵袭，与以往研究结论一致。我们及前人的研究结果表明，miR⁃26b⁃5p 在恶性肿瘤中的作用具有异质性，在肝癌、食管癌、乳腺癌、胶质瘤、肉瘤及结直肠癌中发挥不同作用。

NEF2L3 在多种恶性肿瘤样本中呈高表达，如淋巴瘤，乳腺癌、大肠癌，胰腺癌等，在肿瘤发生发展等生物学进程中起着关键作用。但是，对于NFE2L3 到底是抑癌基因还是促癌基因，不同肿瘤环境下有着不同发现。NEF2L3 对于淋巴肿瘤起着保护作用，为抑癌基因。在肝癌中，NEF2L3 高表达，抑制NEF2L3 可以抑制肝癌细胞增殖，诱导癌细胞凋亡，其机制可能通过Wnt/β⁃catenin 通路发挥作用［26］。在胰腺癌中NEF2L3 高表达，与患者TNM呈正相关，且高表达患者生存期更短，该结果提示NEF2L3 在胰腺癌中为促癌基因。BURY 等［27］发现NEF2L3 在大肠癌患者的样本中显著上调，而且小分子干扰抑制NEF2L3 可抑制大肠癌细胞的生长，增殖和迁移侵袭，其机制可能是通过DUX4/CDK1 复合物发挥作用。CHOWDHURY 等［28］则发现NEF2L3 在大肠癌中有着多重调控机制，正常生理状态下，NEF2L3 可通过HRD1/VCP 复合物标记而被泛素化降解，NEF2L3 通过与sMaf 结合促进UHMK1 的表达，从而促进癌细胞的生长。而在结直肠中，NFE2L3 高表达的患者预后差，生存率低，抑制NFE2L3 可通过CCND1 和pRb1⁃ser807/811。可诱导细胞周期停驻［29］。而实验结果表明，NFE2L3在结直肠癌中上调，其促进癌细胞生长，是癌基因；NFE2L3 受miR⁃26b⁃5p 的调控。因此，NFE2L3 同样存在肿瘤异质性，可能与其上下游不同的机制有关，值得深入探索。

综上所述，miR⁃26b⁃5p 可通过靶向抑制癌基因NEF2L3 的表达抑制肿瘤细胞的生长、迁移和侵袭，从而参与结直肠癌的发生、发展。miR⁃26b⁃5p作为一种抑癌基因NEF2L3 作为致癌基因，可能成为结直肠癌治疗的潜在新靶点。