一例猪流行性腹泻的综合诊断与防治

林淑玲，杨玉栋，马海营，沈叶盛，赵 君†*，孟凡亮*

（1.山东省栖霞市农业农村局，山东 栖霞 265300；2.山东农业大学动物科技学院/山东省动物生物工程与疾病防治重点实验/山东省畜禽疫病防制工程技术研究中心，山东 泰安）

猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒（PED virus，PEDV）引起的以感染猪呕吐、腹泻为主要临床特征的高度传染性肠道疾病，各年龄段猪均易感，尤其对仔猪危害最大。1973年，上海农科院兽医研究所从发生腹泻病猪中分离到一株病毒，经鉴定确认为猪流行性腹泻病毒。该病自 2010年发生较大变异，对我国养猪业造成巨大的经济损失。

PEDV属于尼多病毒目（idovirales）、冠状病毒科（Coronaviridae）、冠状病毒属（Coronavirus）的一种单链 RNA 病毒[1]。该病毒粒子呈多边形，大部分为球型，直径 95～100 nm，由于具有包裹病毒的囊膜结构，因此对有机溶剂敏感，对热相对不敏感[2]。病毒全长28kb左右，编码4个结构蛋白（S、E、M、N）、16个非结构蛋白（NSP1-NSP16）及由ORF3编码的辅助蛋白[3]。其中结构蛋白 S是病毒表面蛋白，与病毒的入侵、体外复制的适应性有关，有报道近几年流行毒株中 S基因出现多处插入与缺失，呈现遗传多样性，因此S基因常用于PEDV遗传进化研究，作为研究其分子生物学特征的主要检测对象[4]。

2021年2月，山东省泰安市某猪场仔猪出现腹泻、呕吐症状，仔猪大批死亡。笔者实地考察后，剖检病死猪，采集病料，经 PCR、病理组织学观察，扩增其 S基因进行遗传进化分析，最终确诊该病例为PEDV感染导致的猪流行性腹泻。针对临床症状采取相应的治疗措施，效果良好。本试验为研究PEDV遗传进化规律提供了一定的理论依据，对目前PEDV的防控具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 发病猪粪便 2021年2月，山东省泰安市某规模化猪场 9日龄仔猪出现腹泻、呕吐症状2 d，表现该症状后的猪仔死亡率近 45 %。剖检送检猪只发现小肠趋于透明，内含有大量黄色液体，为PED的典型症状，疑似PEDV感染。采集发病猪的粪便样品，共8份，置于青霉素瓶中冻存送检。

1.1.2 主要试剂与材料 核酸提取试剂盒（Easypure Viral DNA/RNA Kit）、克隆试剂盒（pEASY-T1 Simlie）均购自北京全式金生物技术有限公司；胶回收试剂盒（Biospin Gel Extraction Kit ）购自杭州博日科技有限公司；琼脂糖粉购自 Sigma 公司；Taq 酶（VazymeHiScript II One Step RT-PCR Kit、DL 2 000 DNAMarker）购自诺威赞（南京）有限公司，其他化学试剂均为分析纯产品。

1.2 方法

1.2.1 临床剖检与病理组织学观察 对病死猪进行病理剖检，观察记录病死猪各脏器组织病变。取肠道样品，4%福尔马林固定，按照常规方式制作石蜡切片，经 HE染色后镜检观察组织病理学变化。

1.2.2 粪便样品处理 每份粪便加入 5倍体积的PBS缓冲液稀释，5 000 r/min 4 ℃ 离心10 min，吸取上清液用于提取 RNA或接种细胞。待 Vero细胞单层密度达 80 % 后，取适量的粪便处理液，经 0.22 μm滤器过滤除菌，DMEM 1:1稀释粪便处理液，然后接种细胞，同时加入适量胰酶，培养3 d后，反复冻融3次后，过滤取1 ml接种下一瓶细胞，如此连续盲传 5代，然后吸取第五代细胞上清液进行PEDV病原检测。

1.2.3 PEDV的PCR检测与遗传进化分析 按照核酸提取试剂盒提取细胞上清 RNA，反转录成cDNA。针对PEDV的S基因设计特异性引物：上游引物；TTCTGAGTCACGAACAGCCA，下游引物：CATATGCAGCCTGCTCTGAA，引物由上海生工合成，使用时稀释为 10 μM。按照VazymeHiScript II One Step RT-PCR Kit（Dye Plus）试剂盒说明书反转录，反应程序为：逆转录，50 ℃ 30 min；预变性，94 ℃ 3 min；变性，94 ℃ 30 s；退火，53 ℃ 30 s；延伸，72 ℃1 min；35个循环；总延伸，72 ℃ 7 min。琼脂糖凝胶电泳 40 min，观察 651 bp处有无特异性条带。将阳性特异性条带进行切胶回收，纯化后，连接 pMD18-T载体构建重组质粒，随后转入大肠杆菌，筛选阳性菌落后，提取质粒，送上海生工测序。测序结果通过 MEGA6软件中的Maximum Likehood tree方法进行该分离菌株的遗传进化分析。

2 结果与分析

2.1 临床剖检结果

患病猪精神沉郁，由于脱水导致形体消瘦，排黄色稀便。剖检病死猪可见肠壁变薄透明，如图 1所示，并在肠腔内聚集大量黄色液体，肠系膜血管充血，且肠系膜淋巴结水肿，肠道乳糜管减少，疑似PEDV感染。

图1 临床剖检症状

2.2 病理组织学观察

组织学病变包括急性弥漫性严重的萎缩性肠炎，盲肠和结肠皮下水肿及浅层上皮细胞轻度空泡化。肠上皮细胞空泡化或大量细胞脱落。萎缩的绒毛发生融合并由退行性或再生的扁平上皮覆盖，在固有层中存在炎性细胞浸润，见图2。

图2 肠道病理组织学观察结肠绒毛萎缩变性，充血出血

2.3 PCR检测结果

提取盲传5代后的细胞上清中的RNA，以反转录后的cDNA为模板，以F：TTCTGAGTCAC GAACAGCCA，R：CATATGCAGCCTGCTCTG AA为引物，进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳，结果如图3所示，采集的8份样品中，有3份为PEDV阳性，阳性率为37.5 %。

图3 临床样品中PEDV的PCR检测结果

2.4 分离毒株TA2020的S基因遗传进化分析

将阳性特异性条带进行切胶回收，连接转化后筛选阳性菌，提取质粒，送上海生工测序。测序结果显示，三份样品 S基因同源性 99.5 % 为同一毒株。通过MEGA6软件中的Maximum Likehood tree方法进行该分离毒株的遗传进化分析。从GeneBank中选取不同年份的8株PEDV序列进行比对，结果发现分离株TA2020属于GII群。

图4 分离株TA2020遗传进化分析（*为分离株）

3 讨论

PEDV于1997年在比利时首次被分离并划分为冠状病毒，20世纪80～90年代该病毒在日本、韩国流行。2005～2008年在意大利、泰国等国时有发生，2010年在我国暴发PED。每一次的暴发流行，都会给当地的养猪产业造成巨大经济损失[5]。本次猪场虽然接种了CV777灭活苗，但仍然检测到 PEDV，这说明类似的疫苗保护性较差。在本研究中，被感染猪为 9日龄哺乳仔猪，患病后死亡率接近95 %，病猪精神沉郁排黄色稀便。剖检病死猪可见肠壁变薄透明，在肠腔内聚集大量黄色液体，并且胃内有乳凝块，肠系膜血管充血，且肠系膜淋巴结水肿，肠道乳糜管减少。病理组织学观察发现，盲肠和结肠皮下水肿及浅层上皮细胞轻度空泡化，这与该病毒的致病机制相关。

此外，取病料检测到PEDV感染，且阳性率为37.5 %，扩增其S基因，并进行序列比对发现其与 SD2014株 S基因同源性 96.67 %，据报道，SD2014株是属于 GII群（突变群），但是此猪场之前免疫的经典毒株CV777属于GI群（经典群），故而分析这可能是导致免疫效果不理想的原因[6]。这一点提示，不同猪场应该根据实际情况，有选择地接种市面上的其他有关 GII群的疫苗株。

此病例提示，在平时要做好预防策略，做好安全措施，加强防御工作，加强保温，定期消毒[7]。养猪户要对猪舍进行大范围的消毒杀菌工作，在猪舍的周围撒上生石灰，防止猪流行性腹泻导致的腹泻的大范围传播，避免对其他的养猪场产生不利影响[8]。有病猪出现时，应立刻病猪注射疫苗、血清或干扰素等，阻止该病毒的蔓延。同时对症治疗，在水中加入口服补盐液以防止脱水，当病猪出现肠道痉挛的现象，用阿托品等来缓解治疗，给病猪服用次硝酸铋、木炭等药物可以止泻；可在病猪的饮水中添加氟苯尼考、丁胺卡那霉素、可以防止病猪肠道进一步感染[9]。

本研究对该猪场暴发的流行性腹泻进行了较为系统的诊断，并提出防控措施，可为该病的诊断和防控提供一定帮助。