分泌型蛋白DKK1在宫颈癌中的表达及其临床意义

杨晴晴，段 畅，王皓梵，蒋冬媛, 田庆丰，封全灵

宫颈癌(cervical cancer,CC)是女性生殖系统中最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和病死率在各大肿瘤中排名第四[1]。在大多数情况下，人乳头状瘤病毒(HPV)的高危亚型是该病的病因，这种病基本上是可以预防的。大约90%的宫颈癌发生在低收入和中等收入国家，这些国家缺乏有组织的筛查和HPV疫苗接种计划[2]。近年来，宫颈癌的发病朝着年轻化方向发展，除了高危的HPV感染因素外，遗传因素和免疫因素也在宫颈癌的发生发展过程中起着重要作用。Wnt家族是进化上高度保守的蛋白质家族，Wnt信号参与了胚胎发育和维持正常成人体内平衡的许多基本过程[3]。这种信号通路的功能障碍可能会导致人类出生缺陷、神经退行性变、骨骼缺陷以及各种癌症，包括胃肠道肿瘤、乳腺癌、上皮性恶性肿瘤等的发生[4-7]。Dickkopf-1(DKK1)是一种分泌型Wnt拮抗剂，在人体组织中参与组织的形成、再生和修复过程[8]。分泌型DKK1被认为通过与LRP6共受体结合来抑制典型Wnt信号传导，阻止激活信号复合物的形成，从而导致胞浆β-catenin降解和核β-catenin依赖基因转录的降低[9]。DKK1表达的失调与多种癌症的转移有关，DKK1表达水平升高与多发性骨髓瘤，前列腺癌和肝细胞癌的不良预后相关[10]。然而，在肾细胞癌和结直肠癌中，DKK1表达水平下调，充当抑癌基因[11-12]。目前，有关DKK1与宫颈癌的关系研究较少。该研究采用RT-PCR技术和免疫组化方法来探讨DKK1在宫颈癌中的表达及其在宫颈癌中的临床意义。

1 材料与方法

1.1 一般资料收集2018年1月—2020年4月在郑州大学第三附属医院手术治疗后经病理证实为宫颈癌的标本30例，所有患者均收集宫颈癌组织和对应的癌旁织，对应癌旁组织距离癌组织均1 cm以上。患者平均年龄26～68(45.0±5.5)岁，以上患者术前均未接受放化疗，标本收集后存放在-80 ℃冰箱中保存，所有患者在获得样本前均获得知情同意。然后，在郑州大学第三附属医院病理中心收集了2015年9月—2018年9月手术治疗后的60例石蜡包埋的宫颈癌样本，以30例因子宫良性病变行子宫全切的患者标本作为对照。根据WHO分级对肿瘤的组织学类型和等级进行分类，根据国际妇产科联合会(FIGO)标准确定肿瘤分期。

1.2 方法

1.2.1RNA提取和实时定量逆转录酶聚合酶链反应(qRT-PCR) 使用TRIzol试剂(美国Invitrogen公司)从临床组织中提取总RNA，根据制造商的说明，使用RT-for-PCR试剂盒(日本Takara公司)将1 μg RNA转化为cDNA(反应系统10 μl)。将2 μl cDNA与SYBR Green混合后，使用CFX96TMReal-Time系统(Bio-Rad)进行定量实时qPCR(RT-qPCR)(反应系统20 μl)：95 ℃、5 min，95 ℃、30 s,56 ℃、30 s,72 ℃、30 s,40个循环。GAPDH的上游引物：5′-CAGGGCTGCTTTTAACTCTG-3′，下游引物：5′-CTGTTGTCGGAGTTCTAGTAG-3′；DKK1的上游引物：5′-TATCACACCAAAGGACAAG-3′,下游引物：5′-TGATGGTGATCTTTCTGTAT-3′；GAPDH用作内部对照，使用2-△△Ct法计算基因相对表达，独立重复实验3次。

1.2.2免疫组化法 通过免疫组化分析检测60例宫颈癌组织，30例正常组织。将5 μm厚的石蜡包埋切片在60 ℃下烘烤1 h，用二甲苯脱石蜡，再水化，用EDTA缓冲液高压处理进行抗原修复，再用PBS冲洗3遍，非特异性抗体用0.5%小牛血清白蛋白来封闭15 min，加一定稀释度的一抗 50 μl(1 ∶500)，阴性对照用PBS，用已验证的阳性切片为阳性对照，放4 ℃冰箱中孵育过夜。生物素标记羊抗兔IgG 50 μl滴加在每张切片上，每张切片上滴加50 μl链霉亲和素-过氧化物酶溶液，Tris缓冲液震洗3次，5 min/次。在显微镜下，用0.04% DAB-H2O2显色5～20 min。用苏木精复染细胞核，用乙醇分化 ，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片观察。 请2名病理科医师，采用双盲法观察免疫组化染色后的组织并评分。阳性细胞判断标准：根据胞浆染色情况和阳性细胞数来判定蛋白的表达水平。先按染色强度打分：无色记0分，浅黄色记1分，棕黄色记2分，棕褐色记3分；再按阳性细胞百分比打分：阳性细胞数≤10%为0分，10%～25%为1分，25%～50%为2分，50%～75%为3分，>75%为4分；染色强度分数×阳性细胞百分比分数≥2为阳性，染色强度分数×阳性细胞百分比分数<2分为阴性。

2 结果

2.1 检测30例冰冻宫颈癌组织中DKK1的表达量qRT-PCR 结果显示，CC组中DKK1 mRNA的表达量小于癌旁对照组中DKK1 mRNA的表达量，差异有统计学意义(t=4.019,P<0.05)。见图1。

图1 DKK1 mRNA在癌组织和癌旁组织中的表达量与癌旁组织比较：*P<0.05

2.2 CC组和对照组临床病理特征60例CC组患者和30例对照组临床病理特征见表1，根据临床病例报告显示，CC组和对照组在年龄、初潮年龄、绝经状态、妊娠次数、分娩次数和癌症家族史等方面差异无统计学意义。但是，与对照组相比，DKK1在CC组的表达低于对照组，差异有统计学意义(P=0.032),见图2、表2。

表1 CC组和对照组的部分临床特征

图2 DKK1蛋白在CC组织和正常宫颈组织中的表达A：DKK1在CC组织中低表达 ×100；B：DKK1在CC组织中低表达 ×400；C：DKK1在正常宫颈组织中高表达 ×100；D：DKK1在正常宫颈组织中高表达 ×400

表2 DKK1在宫颈癌组织和正常宫颈组织中的表达(n)

2.3 DKK1表达与宫颈癌组织的临床病理特征的关系χ2检验显示(表3)，DKK1蛋白表达与年龄、肿瘤大小、HPV感染和组织学类型无关(P>0.05)。在宫颈癌早期中的表达高于晚期(P=0.031),无盆腔淋巴结转移组高于有淋巴结转移组(P=0.017)，浸润深度浅肌层组高于深肌层组(P=0.009)，高分化组的表达高于低分化组(P=0.022)。此外，斯皮尔曼相关分析显示，DKK1表达与与患者年龄(ρ=-0.129，P=0.324)、肿瘤大小(ρ=-0.158，P=0.228)、HPV有无感染(ρ=0.184，P=0.159)以及组织病理类型(ρ=-0.094，P=0.473)无明显相关。DKK1低表达与临床病理分期(ρ=-0.279，P=0.031)、组织分化程度(ρ=-0.295，P=0.022)、有无淋巴结转移(ρ=-0.307，P=0.017)及浸润深度(ρ=-0.339，P=0.008)密切相关，相关性为负相关，这些结果表明DKK1低表达可能在宫颈癌的发生发展中起到重要作用。

表3 DKK1表达与宫颈癌组织的临床病理特征的关系[n(%)]

3 讨论

在女性癌症患者中，宫颈癌排名第四，尽管宫颈癌的发病率和病死率呈下降趋势，但它仍然是威胁女性生命健康的重要“杀手”。目前，宫颈癌的主要治疗方法是手术、化疗、放疗和联合治疗等，但对于晚期转移患者治疗效果并不理想。宫颈癌的发展是一个多基因、多步骤的癌变过程，涉及癌基因、抑癌基因的失活及基因调控的失衡等[13]。最近研究证实Wnt信号通路在肿瘤的转移和免疫监视中具有重要意义，Wnt通路通常分为β-连环蛋白依赖(典型)和独立(非典型)信号通路。DKK1是DKK蛋白家族的一部分，属于分泌型Wnt糖蛋白，这种分泌蛋白具有高度保守的半胱氨酸结构域，它能抑制Wnt/ β-连环蛋白信号转导，Wnt配体通过与Frizzled受体和低密度脂蛋白受体相关蛋白-5/6(LRP5/6)结合激活Wnt信号通路，导致β-catenin的核移位，而DKK1与LRP5/6竞争性结合，阻止Wnt-Frizzled-LRP5/6复合物的形成，从而阻断Wnt信号通路，引起蛋白酶体β-catenin降解、诱导凋亡和阻止细胞增殖[14]。

DKK1的功能在不同类型的癌症中有所不同。一些研究者认为DKK1是一种抑制肿瘤细胞增殖和转移的抑癌基因，如DKK1在肾细胞癌和结直肠癌中下调，在肺癌患者血清中也显著降低，治疗后能迅速恢复正常水平[11]。然而，一些研究认为DKK1的高表达是独立有害的因子，如DKK1在肝细胞癌和骨髓瘤中作为癌基因过度表达，在乳腺癌细胞中还参与骨转移[15]。在众多癌症研究的基础上，该研究采用RT-PCR技术和免疫组化法检测DKK1在宫颈癌组织中的表达。结果显示在转录水平上，DKK1在宫颈癌组织中的mRNA表达量低于癌旁正常组织，在蛋白质水平上，免疫组化显示DKK1在宫颈癌组织中低表达，由此分析在正常宫颈发展为宫颈癌的过程中，DKK1下调可能促进其发生，具有肿瘤启动子的特性。另外，DKK1作为Wnt信号通路中的核心成员，它的表达与肿瘤生长分化和向远处转移密切相关，这一过程常涉及癌细胞失去上皮特征而获得间质特性，血管生成和上皮间质转化及淋巴扩散均受Wnt信号传导的调控[16]。该研究对免疫组化的结果进行临床分析显示宫颈癌中DKK1的表达水平在临床病理分期越高、有淋巴结转移、侵入深肌层和低分化状态中减少，由此可见DKK1下调可能与宫颈癌的恶性发展相关，是促进宫颈癌进一步恶化的重要因子。

从HPV感染到宫颈癌的发生是一个相对缓慢的过程，多数HPV感染是“一过性”的，并不引致宫颈病变，高危型HPV的持续感染是宫颈癌的主要病因。高危型HPV感染中，约70%与HPV16型和HPV18型相关，高危型HPV产物E6蛋白结合抑癌基因p53，通过刺激泛素化介导p53蛋白降解。同样，高危型HPV产物E7蛋白抑制pRb抑癌蛋白活性，导致细胞恶性增殖[17]。根据免疫组化结果，该研究采用斯皮尔曼相关分析DKK1表达与宫颈癌组织的临床病理特征的关系，结果并未显示DKK1的表达与患者年龄、肿瘤大小、HPV有无感染以及组织病理类型明显相关。

综上所述，在宫颈癌中，DKK1是抑制肿瘤细胞增殖和迁移的抑癌基因，可能作为抑制性配体拮抗Wnt信号转导。DKK1在宫颈癌组织中表达的临床意义需要大样本数据，本次免疫组化的样本量不足够，存在局限性。另外，该实验未涉及DKK1在宫颈癌中的发生发展机制研究，还需进一步深入探讨。