脂联素对脓毒症小鼠心肌损伤的保护作用及其机制

刘鲁倩，陈 玲，秦叙青,3，何文君，杨 瑞,3，单莉娅,3，李新芝，马克涛,3

脓毒症是危害人类健康的一大疾病，尽管抗感染的水平有了很大的提高，但是脓毒症病死率依然居高不下[1-2]。其中，脓毒症心肌损伤是脓毒症及多器官功能衰竭的重要表现，其发病率较高，预后较差，涉及多种信号分子机制，如细胞凋亡、钙离子转运障碍等。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是一种内毒素，由革兰阴性细菌产生，可以引起炎症和心肌细胞凋亡。因此，抑制LPS引起的心肌损伤可能会成为脓毒症治疗的突破口。脂联素(adiponectin，APN)是一种细胞因子，由脂肪细胞合成和分泌，大约占血浆总蛋白的0.01%[3]。APN具有抗炎，抗动脉粥样硬化的作用[4]，对心脑血管疾病的发生发展亦起着调控作用[5]。但是APN对LPS诱导的小鼠脓毒症心肌损伤的保护作用以及可能的机制，目前尚不明确。该研究旨在通过LPS诱导小鼠脓毒症心肌损伤，探讨APN是否有保护作用及其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与模型制备选取体质量控制在(25±5)g的健康雄性C57BL/6J小鼠30只，该小鼠购买于北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物合格证号：SCXK(京)2016-0006。将所有的C57BL/6J小鼠置于石河子大学动物实验饲养中心，并按照石河子大学动物实验伦理委员会的要求进行整个实验。所有小鼠在适宜温度下饲养，湿度和光线良好。所有的小鼠适应性喂养1周后，将30只小鼠随机分为3组，10只/组，分为假手术组(sham组)、脓毒症心肌损伤组(LPS组)、脂联素干预组(LPS+APN组)。参考前期文献[6]的方法每只小鼠腹腔注射10 mg/kg的革兰阴性细菌LPS以制备脓毒症心肌损伤模型，同时sham组予以等量的0.9%氯化钠溶液进行腹腔注射，LPS+APN组于注射LPS前12 h给予腹腔注射6 mg/kg[7]的脂联素，12 h后小鼠处死，并进行实验检测。

1.2 主要试剂APN(美国PeproTech公司)；脂多糖(美国sigma公司)；凋亡相关蛋白如兔抗Bax抗体(货号ab199677)、兔抗Bcl2抗体(货号ab196495)、兔抗Caspase3抗体(货号ab13847)以及兔抗连接蛋白43(Cx43)抗体(货号ab11370)均购于美国Abcam公司；小鼠抗β-actin抗体、小鼠抗GAPDH抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG和辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG均购于北京中衫金桥生物技术有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1心肌HE染色 将每组心肌组织置于10%甲醛中过夜，然后脱水并包埋在石蜡中。将所有心肌组织切成5 μm厚的切片，固定在载玻片上并烘烤干燥，然后染色。根据使用说明书，将切片分别浸入二甲苯、浓度梯度的乙醇和苏木精中，并用中性树胶密封。使用光学显微镜观察心肌细胞、心脏基质和肌丝的形态。

1.3.2Western blot法检测各组凋亡蛋白Bax、Caspase-3、Bcl-2以及Cx43的表达 各组造模结束后，迅速取出小鼠心肌组织，用研磨机将心肌组织打碎，加入裂解液在冰上裂解至少20 min，每隔10 min摇匀一下，4 ℃离心组织并用BCA法测蛋白浓度并配平，待蛋白冷却后分装储存。用SDS-PAGE分离，电泳结束后将蛋白转移至PVDF膜上电转，电转结束后，用TBST洗去多余的电转液，并用50 g/L脱脂牛奶室温封闭2 h，封闭结束后，加入以下抗体4 ℃过夜：兔抗Bax抗体(1 ∶1 000)、兔抗Bcl-2抗体(1 ∶1 000)、兔抗Caspase3抗体(1 ∶1 000)、兔抗Cx43抗体(1 ∶1 000)、小鼠抗β-actin抗体(1 ∶1 000)和小鼠抗GAPDH抗体(1 ∶1 000)。次日，用TBST洗膜3次，10 min/次，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(1 ∶5 000)和辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG(1 ∶10 000)室温孵育2 h，用TBST洗去二抗，于暗室中滴加发光试剂，压片、显影、定影，使用Quantity One软件(Bio-Rad公司)获取图像并分析。

1.3.3免疫组织化学染色 将心肌组织切片在60 ℃的烤箱中烘烤2 h，分别用二甲苯脱蜡3次，5 min/次，100%、90%、80%、70%乙醇脱水，5 min/次，自来水冲洗干净，枸橼酸钠修复并用3%的过氧化氢抑制内源性过氧化酶活性，用山羊血清37 ℃封闭1 h，随后，加入相应的一抗(Bax，1 ∶100；Bcl-2，1 ∶100；Caspase3，1 ∶100；Cx43，1 ∶100)4 ℃过夜，次日，洗净一抗后加入二抗，37 ℃孵育1 h，加入DAB显色，待标本抗体标记的阳性部位显色后，立即用自来水冲洗掉，接着，用苏木精复染3 min，自来水洗3次，1%盐酸酒精分化6～7 s，自来水冲洗3次，然后自来水蓝化3 min，并在70%、80%、90%、100%乙醇脱水，烘干后中性树胶封片。随机选择6个样本/组，并在每个样本中随机选择5个视野，然后在光学显微镜下拍照。

2 结果

2.1 各组心肌组织病理学观察sham组心肌纤维排列整齐且胞质丰富均匀，细胞间隙正常，边界清晰，无病理变化；LPS组可见多数炎性细胞浸润，且伴有心肌细胞坏死情况；LPS+APN组心肌细胞坏死情况改善，心肌纤维数量增多，心肌损伤情况降低，炎性细胞浸润减少。见图1。

图1 各组小鼠心肌组织的HE ×400A：sham组；B：LPS组；C：LPS+APN组

2.2 各组凋亡蛋白指标Caspase3、Bcl-2、Bax表达通过Western blot检测sham、LPS、LPS+APN组各指标蛋白相对表达量。与sham组比，LPS组促凋亡蛋白cleaved caspase3、Bax表达增高，然而抗凋亡蛋白Bcl-2表达低于sham组,LPS+APN组cleaved caspase3、Bax蛋白表达低于LPS组,Bcl-2蛋白表达高于LPS组(P<0.05)。同时进行免疫组织化学染色检测各组心肌组织Caspase、Bcl-2、Bax蛋白表达，Caspase3及Bax的表达情况：sham组中偶见棕黄色颗粒，LPS组的表达明显高于sham组，LPS+APN中棕黄色颗粒明显降低。Bcl-2的表达情况：

sham组中可见棕黄色颗粒表达，LPS组的表达明显低于sham组，LPS+APN中棕黄色颗粒表达明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2、3。

图2 Western blot法检测各组小鼠心肌组织中凋亡蛋白A：Western blot法检测心肌组织内凋亡蛋白cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表达；B：心肌组织内凋亡蛋白cleaved caspase-3蛋白水平的半定量分析；C：心肌组织内凋亡蛋白Bcl-2蛋白水平的半定量分析；D: 心肌组织内凋亡蛋白Bax蛋白水平的半定量分析；1：sham组；2：LPS组；3：LPS+APN组；与sham组比较：**P<0.01；与 LPS组比较：#P<0.05，##P<0.01

图3 免疫组织化学染色检测心肌组织中Caspase3、 Bax、Bcl2蛋白表达 ×400A：心肌组织内凋亡蛋白Caspase3蛋白表达；B：心肌组织内凋亡蛋白Bax蛋白表达；C: 心肌组织内凋亡蛋白Bcl-2蛋白表达；1：sham组；2：LPS组；3：LPS+APN组

2.3 各组Cx43的表达通过Western blot检测sham组、LPS组、LPS+APN组Cx43相对表达量。与sham组比较，LPS组Cx43的表达增高，然而LPS+APN组Cx43的表达低于LPS组(P<0.05)。免疫组织化学染色检测各组心肌组织中Cx43的表达：sham组中可见棕黄色颗粒，LPS组的表达高于sham组，LPS+APN中棕黄色颗粒明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图4、5。

图4 Western blot法检测各组小鼠心肌组织中Cx43 A：Western blot法检测心肌组织Cx43的表达；B：心肌组织内Cx43水平的半定量分析；1：sham组；2：LPS组；3：LPS+APN组；与sham组比较：*P<0.05；与LPS组比较：#P<0.05

图5 免疫组织化学染色检测心肌组织中Cx43的表达 ×400A：sham组；B：LPS组；C：LPS+APN组

3 讨论

临床上，脓毒症具有起病快、发病急、病死率高等特点，发生脓毒症时，炎症、氧化应激、线粒体损伤、微循环障碍、免疫紊乱、自噬损伤、凋亡等病理机制使全身各种组织和器官损伤，最终导致多器官功能衰竭。其中，脓毒症心肌损伤是脓毒症多器官功能衰竭的一个重要环节，越来越多的研究[8]表明，因脓毒症感染性休克的患者多表现为心功能不全。因此，保护心脏功能是治疗脓毒症的一个重要环节。目前已经有研究[9]报道腹腔注射脂多糖可以诱发脓毒症且导致心脏损伤，该研究使用LPS诱导脓毒症心肌损伤,与前期的研究结果一致，实验显示，注射LPS可使小鼠诱发脓毒症，且会发生脓毒症心肌损伤,具体表现为心肌组织有多数炎性细胞浸润，且伴有心肌细胞坏死情况。APN具有多种作用，如抗炎、抗凋亡和抗动脉粥样硬化。既往的研究[10]表明APN有心脏保护作用。该研究提示，APN可保护LPS所致的脓毒症心肌损伤，APN预处理后，心肌组织中炎性细胞浸润及心肌细胞坏死情况明显缓解，心肌纤维数量增多，心肌损伤获得改善。

许多调节因子在脓毒症心肌损伤的发病机制中起着至关重要的作用[11]。细胞凋亡已被证明是心脏功能下降的主要原因之一[12]。有研究[13]表明脓毒症休克大鼠心肌细胞会发生凋亡，并证实凋亡在脓毒症诱导的儿童心肌抑制中起着更重要的作用。本研究中，也出现了类似的结果，与假手术组相比，脓毒症心肌损伤组凋亡蛋白Caspase3、Bax表达水平明显增多，抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调，使用脂联素干预后，脓毒症心肌损伤的凋亡蛋白指标明显改变，与脓毒症心肌损伤组相比，凋亡蛋白Caspase3、Bax表达水平明显降低，抗凋亡蛋白Bcl-2表达增高。实验表明，APN可以通过调节细胞凋亡来保护脓毒症心肌损伤 。

缝隙连接是一种膜通道结构，介导细胞间的通讯，存在于两个细胞之间，具有重要的生物学功能。Cx43是最主要的缝隙连接蛋白，尤其在心室肌中，对于电传导发挥着不可或缺的作用。有学者发现在肥厚型心肌病、心力衰竭、缺血性心肌病等多种心脏病中，Cx43的分布和表达均发生改变[14]。Cx43在细胞生长、增殖和凋亡中起重要作用。林俊敏 等[15]研究证明，在心力衰竭大鼠心脏中Cx43表达明显增加，且分布紊乱。该实验显示，与假手术组相比，脓毒症心肌损伤组Cx43的蛋白表达明显增高，使用APN预处理后，Cx43的水平有所降低，提示APN可能通过调节Cx43的表达来保护脓毒症心肌损伤。

综上所述，该研究表明，APN可有效地保护脓毒症心肌损伤，其机制可能是调节细胞凋亡途径以及Cx43的表达。因此，APN为临床上治疗脓毒症心肌损伤成为了一种新的可能。