单肺通气诱发兔肺损伤时花生四烯酸代谢通路变化及丹参多酚酸盐的干预研究

陈 华，张柏盛，龙小平

胸外科手术(如食管癌根治术、肺叶切除术等)的通气方式通常首选单肺通气(one lung ventilation,OLV)技术，通过隔离患侧肺，从而使气道通畅，避免发生交叉感染，同时为手术治疗建立良好的操作环境[1-2]。但是此技术会增加肺内分流与气道阻力，危及肺泡氧合机能与肺组织顺应性，造成急性肺损伤，对患者生命与术后恢复产生极大危害[3-4]。

丹参多酚酸盐是从丹参中提取的一种水溶性有效成分，与传统丹参注射液相比，具有疗效稳定、毒副反应小、质量容易监控等优点，临床上主要用于冠心病的治疗[5-6]。丹参多酚酸盐对急性肺损伤有保护作用，但对OLV诱发肺损伤的保护机制尚不清楚。该研究通过建立兔OLV模型，探讨丹参多酚酸盐对其所产生的效用以及可能机制，为后续研究提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 动物与分组24只健康雌、雄性6月龄日本白兔，体质量2.2～2.5 kg，购自广东省医学科学院医学研究中心，许可证号：SCXK(粤)2015-0022。使用许可证号SYXK(湘)2017-0015。实验动物随机分为对照组、模型组、治疗组，每组8只；对照组：行假手术，暴露气管、左颈总动脉和右颈外静脉，经2～3个气管环行气管切开，置入气管(内径2.0 mm)，双肺通气3 h；模型组：调整气管导管至右主支气管，行机械通气2 h，OLV 3 h；治疗组在OLV前给予丹参多酚酸盐30 mg/kg静脉滴注，其余与模型组相同。3组均采用容量通气模式，通气频率40次/min，OLVVT为12 ml，FiO2100%。试验结束后2 h开胸取肺组织，部分于4%多聚甲醛中固定，剩余肺组织于液氮中保存。实验过程符合动物3R原则。

1.2 仪器与试剂丹参多酚酸盐(上海绿谷药业)；花生四烯酸(arachidonic acid, AA)、白三烯B4(leukotriene B4, LTB4)、血栓素B2(thromboxane B2,TXB2)和6-keto-PGF1α检测ELISA试剂盒(上海樊克生物科技有限公司)；环氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)、5-脂氧化酶(5-lipoxygenase, 5-LOX)、Clara细胞分泌蛋白(clara cell secretory protein, CCSP)和胞质型磷脂酶A2(cytoplasmic phospholipase A2,C-PLA2)抗体(美国Sigma公司);逆转录和 PCR 反应试剂(日本Invitrogen公司)；TRIzol 试剂盒(美国TaKaRa公司)；多功能麻醉机(美国Datex Ohmeda公司)；H500型透射电子显微镜(日本Hitachi公司)；9600PCR 扩增仪(美国PE公司)。

1.3 肺湿/干重值(wet / dry weight, W/D值)取兔右肺下叶组织称湿重，然后置于恒温烤箱中(80 ℃、72 h)烘烤，至恒重后称干重，计算肺湿/干重之比(W/D值)。

1.4 肺组织学评分取右肺组织，浸泡于4%多聚甲醛中固定24 h，常规脱水、石蜡包埋、二甲苯脱蜡、经各级乙醇溶液至水洗，然后HE染色，中性树胶封片，显微镜下观察。

1.5 透射电子显微镜肺组织标本用2.5%戊二醛固定，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗，再1%四氧化锇固定2 h，样品在室温下通过丙酮脱水，环氧树脂Epon812包埋，切片，用透射电镜检查。

1.6 ELISA法检测肺组织中AA、LTB4、6-keto-PGF1α和TXB2含量由于血栓素A2(thromboxane A2, TXA2)和前列环素(prostacyclin 2, PGI2)组织半衰期分别为30 s、3 min，因此判断浓度采用其稳定代谢产物TXB2和6-酮-前列环素F1α(6-keto-PGF1α)值作为指标。按照ELISA试剂盒说明书操作，检测兔肺中AA、6-keto-PGF1和TXB2的含量。

1.7 RT-qPCR检测兔肺组织COX-2、5-LOX mRNA表达水平取重约50 mg肺组织，置于TRIzol中提取总RNA，并测定总RNA浓度。按逆转录试剂盒说明书合成cDNA，采用SYBR Green MasterMix试剂盒(美国Kapa公司)进行实时定量PCR实验。β-actin作为内参，上游引物：5′-AGAGAACACCCAA GCCACT-3′；下游引物：5′-GGCATCGGAAAGGCACA AACG-3′。5-LOX上游引物：5′-GCCGTCTATGAACA CGCGTGT-3′；下游引物：5′-GTCTCTAGATGAAGTTG G-3′。COX-2上游引物：5′-TCAGTCGATCACGAGTGA-3′；下游引物：5′-CTAATGACAAGCCAGGGA-3′。以2-ΔΔCt计算各样品表达量的相对值，对照组相对值均设为1。

1.8 Western blot法检测AA代谢途径相关蛋白表达取肺组织100 mg，加1 ml组织裂解液，匀浆后经BCA法测定蛋白浓度。采用SDS-PAGE 凝胶电泳、转膜、封闭后，加一抗、二抗孵育，用TBST漂洗10 min×3次，室温下反应1 h，采用ECL显影。

2 结果

2.1 肺W/D值与对照组相比，模型组肺W/D值升高(P<0.05)，而治疗组肺W/D值低于模型组(P<0.05)，见图1。

图1 兔肺W/D值与对照组比较：*P<0.05；与模型组比较：#P<0.05

2.2 肺组织HE染色及评分对照组肺组织无明显病理改变；模型组毛细血管扩张充血，肺泡腔内有红色渗出物，肺泡壁增厚，炎性细胞浸润；治疗组部分肺泡破坏融合，肺间质有少量红细胞以及炎性细胞浸润，与模型组比较有所减轻，见图2。

图2 3组肺组织HE染色 ×100A：对照组；B：模型组；C：治疗组

2.3 透射电镜观察肺组织病理学改变对照组显示肺泡Ⅰ型上皮细胞(alveolar epithelial cell I,AT-Ⅰ)损伤较轻。而模型组线粒体肿胀，多数线粒体嵴断裂甚至消失空泡变性，内质网显著扩张，形成不同大小的液泡变性。治疗组AT-Ⅰ超微结构损伤较模型组明显改善，见图3。

图3 各组肺组织超微结构的变化 ×50 000A：对照组；B：模型组；C：治疗组；黑色箭头：线粒体；红色箭头：内质网

2.4 各组肺组织中AA、LTB4、TXA2、PGI2含量比较与对照组相比，模型组或治疗组肺组织中AA、LTB4、TXA2和PGI2含量上升(t=6.39、9.31、5.98、7.05，P<0.05;t=2.17、9.01、1.79、6.33，P<0.05)；与模型组相比，治疗组肺组织中AA、LTB4、TXA2和PGI2含量下降(t=3.87、2.76、1.43、2.22，P<0.05)，见图4。

图4 各组肺组织中LTB4、TXA2、PGI2、AA含量A: LTB4含量；B: PGI2(6-k-PGF1α)含量；C: TXA2(TXB2)含量；D: AA含量；与对照组比较：*P<0.05；与模型组比较：#P<0.05

2.5 各组肺组织中COX-2、5-LOX mRNA表达水平与对照组相比，模型组或治疗组兔肺组织中5-LOX、COX-2 mRNA表达水平上升(t=30.55、27.89，P<0.01；t=77.31、12.30，P<0.01)，而与模型组相比，治疗组兔肺组织中COX-2、5-LOX mRNA表达水平下降(t=18.16、18.55，P<0.01)，见图5。

图5 肺组织中COX-2、5-LOX 表达A: 5-LOX mRNA相对表达；B: COX-2 mRNA相对表达；与对照组比较：**P<0.01；与模型组比较：##P<0.01

2.6 各组肺组织COX-2、5-LOX、CCSP和C-PLA2蛋白表达与对照组相比，模型组兔肺组织中COX-2、5-LOX 和C-PLA2蛋白表达上升，而CCSP蛋白表达下降；与模型组相比，治疗组兔肺组织中COX-2、5-LOX 和C-PLA2蛋白表达下降，而CCSP蛋白表达上升，见图6。

图6 各组肺组织中COX-2、5-LOX、CCSP和C-PLA2蛋白表达

3 讨论

OLV拓展了胸科手术适应证，改善了手术条件，近年随着胸腔镜技术的成熟，其应用更加广泛。但这种通气方式属于非生理性通气，会提高气道阻力、减弱肺顺应性及肺泡局部通气机能，术中易发生低氧血症，使肺部缺血症状加剧，导致肺损伤更为严重[7]。

经大量研究[5]证实，丹参多酚酸盐具有多环节、多靶点的药理作用特点，不仅有抗心肌缺血、保护缺血-再灌注损伤、保护心肌等作用，还有保护肝胆、改善肾功能等作用。本研究拟评价经丹参多酚酸盐治疗后对OLV诱发肺损伤的效用及对AA代谢途径的影响，以期为明确可能作用机制提供参考。

W/D值结果显示：模型组W/D值高于对照组，而经丹参多酚酸盐治疗后W/D值下降。这说明OLV会诱发肺损伤，致使W/D值上升；透射电镜观察显示：对照组显示AT-Ⅰ损伤较轻，而模型组线粒体肿胀，内质网显著扩张。治疗组AT-Ⅰ超微结构损伤较模型组明显改善。这也证实OLV对肺组织产生损伤作用，而经丹参多酚酸盐治疗后能明显改善状况，具有保护作用。

AA及其代谢物质如白三烯类(LTs)、TXA2、前列腺素类等是具有广泛生物学活性的重要炎性介质，在许多疾病的发生发展中起着重要作用[8-10]。对于哺乳动物而言，AA代谢途径主要有2类[11-12]：① 脂氧化酶(LOX)途径，大多源自5-LOX发挥致炎效能；② 环氧化酶(COX)途径。此途径可分泌PGE2、TXA2、PGF2与PGI2等生物活性物质。文献[13]报道，众多的AA代谢产物中，对炎症反应影响最大的是PGI2，其抑制血小板聚集、舒张血管方面表现出强大作用；TXA2具有很强的收缩血管作用，可诱发血栓及加速血小板聚集。在LOX途径中，5-LOX是催化AA生成LTs物质的为主要途径[14]。其中代谢产物LTB4对炎症反应影响较大，与多种疾病的炎症反应密切相关。ELISA检测结果显示模型组肺组织中AA、LTB4、PGI2、TXA2含量均高于对照组，而丹参多酚酸盐治疗后上述含量较模型组均下降。这说明OLV诱发的肺损伤会引起AA代谢途径炎性物质的大量生成，而丹参多酚酸盐能起到抑制AA代谢途径的作用。

Western blot和RT-qPCR结果显示，模型组肺组织中5-LOX、COX-2蛋白和mRNA表达水平上升，出现急性肺损伤，而经丹参多酚酸盐治疗后5-LOX、COX-2蛋白和mRNA表达下降。这提示OLV能使5-LOX 与COX-2这两条代谢途径活化，导致经其产生的AA代谢产物增加，出现肺损伤，而丹参多酚酸盐对5-LOX 与COX-2这两条代谢途径均有抑制作用，因此能够起到减轻急性肺损伤作用；C-PLA2广泛参与人体炎症反应，通过催化细胞内膜磷脂水解，产生以AA为主的游离脂肪酸和溶血磷脂，因此被认作是AA类产物生成及其所致后续炎症反应中最为重要的酶。而Clara细胞分泌蛋白是Clara细胞的主要分泌产物，被认为是PLA2强烈的内源性抑制剂，具有较强的抗炎作用。Western blot结果还显示，与模型组相比，治疗组肺组织C-PLA2表达下降，而CCSP表达上升。这说明丹参多酚酸盐能够下调C-PLA2表达，上调CCSP表达，抑制AA等炎性产物生成，继而对OLV诱发的肺损伤起到保护功效。由上述结果推测，丹参多酚酸盐可能通过抑制5-LOX，下调该途径主要产物LTB4表达，从而减少TXA2生成，起到炎症抑制作用。同时，丹参多酚酸盐还能通过抑制COX-2表达，从而减少代谢产物PGI2产生，进而下调TXA2生成。

综上，本研究证实OLV可激活COX和5-LOX途径导致AA代谢增加，而丹参多酚酸盐可能通过下调5-LOX、COX-2、C-PLA2表达，上调CCSP表达从而抑制AA代谢途径，对OLV诱发的肺损伤产生保护作用。