离子色谱法测定盐酸米托蒽醌注射液中抗氧剂焦亚硫酸钠的含量

陈宁，张远杏，黄权华

（深圳华润九新药业有限公司，广东 深圳 518049）

盐酸米托蒽醌在临床上又称米西宁，属于蒽醌类化疗药物，其化学结构与阿霉素相似，同属细胞周期非特异性的广谱抗癌药，抗肿瘤活性优于或等同于阿霉素类药物，而心脏毒性则较阿霉素轻，临床上主要用于治疗恶性淋巴瘤、晚期乳腺癌等疾病［1‑2］。抗氧剂是注射液中一种普遍使用的附加剂，可延缓药物氧化，增加药物的稳定性和有效性［3］。注射剂中常用的抗氧剂有亚硫酸钠、亚硫酸氢钠和焦亚硫酸钠等，一般浓度为0.1%~0.2%。本研究中盐酸米托蒽醌注射液中添加的抗氧剂为焦亚硫酸钠，处方浓度为10μg/mL。抗氧剂作为功能性辅料，有必要对其在效期内的含量变化进行检测。

对于焦亚硫酸钠的测定，常用的检测方法主要包括电位滴定法、紫外分光光度法、液相色谱法和离子色谱法等［4‑11］。其中，电位滴定法测定注射液时，所需样品量较大、灵敏度较低，不适用于制剂中痕量焦亚硫酸钠的测定；使用紫外分光光度法和液相色谱法时，由于盐酸米托蒽醌注射液为深蓝色蒽醌类注射液，颜色较深，且盐酸米托蒽醌干扰焦亚硫酸钠的测定导致准确度不够；而离子色谱法具有专属、灵敏、准确性高的优点，应用前景良好。本文利用离子色谱法对含有强紫外吸收成分的蒽醌类注射液中的焦亚硫酸钠含量进行了测定，解决了盐酸米托蒽醌干扰焦亚硫酸钠测定这一问题，为蒽醌类注射液中抗氧剂焦亚硫酸钠含量的测定提供了一种高效、可靠的方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Dionex AQ‑1200型离子色谱仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；XS205 Dual Range型电子分析天平（瑞士Mettler‑Toledo公司）。

1.2 试药

盐酸米托蒽醌注射液（批号：011190801、011190802、011190803、011190804、011190805、011190806、011190901、20180101、20180102、20180103，深圳华润九新药业有限公司）；诺肖林（批号：P00033S，Pharma GmbH Co.KG）；焦亚硫酸 钠（Aladdin，批 号：J1816049，质 量 分 数：99.99%）；甲醛（分析纯，广州化学试剂厂）；超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：DionexⅠonPac AS11‑HC（4.0mm×250mm）；检测器：电导检测器；流速：1.0 mL/min；柱温：30℃；进样量：25μL；淋洗液：KOH溶液（淋洗液自动发生器），按表1进行梯度洗脱。

表1 梯度洗脱程序Table 1 The gradient elution program

2.2 溶液的配制

2.2.1 稀释剂（稳定剂）0.2%（体积分数，下同）甲醛水溶液。

2.2.2 对照品储备液 取焦亚硫酸钠10.17 mg，精密称定，置100 mL棕色量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。

2.2.3 对照品溶液 精密量取对照品储备液1 mL，置10 mL棕色量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

2.2.4 供试品溶液 精密量取盐酸米托蒽醌注射液1 mL，置10 mL棕色量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，用0.22μm滤膜过滤，续滤液作为供试品溶液。

2.3 方法学验证

2.3.1 系统适用性试验 取“2.2”项下对照品储备液，稀释成质量浓度为10μg/mL的标准溶液作为系统适用性溶液。取上述溶液25μL注入离子色谱仪，记录色谱图见图1。可见，在该色谱条件下，焦亚硫酸钠色谱峰与相邻辅料色谱峰分离度为2.64，理论塔板数为11 605，符合要求。

图1 系统适用性试验的色谱图Figure 1 Chromatogram of system suitability solution

2.3.2 专属性试验 空白溶剂溶液：取0.2%甲醛溶液作为溶剂空白溶液。混合辅料空白溶液：按处方比例分别称取除焦亚硫酸钠外的各辅料，共置1 L量瓶中，超纯水溶解，定容至刻度，摇匀，精密移取1 mL至10 mL棕色量瓶中，加入0.2%甲醛溶液稀释至刻度，摇匀，用0.22μm滤膜过滤，续滤液作为混合辅料空白溶液。对照品溶液：同“2.2”项下对照品溶液。加标供试品溶液：分别精密量取对照品储备液1 mL、盐酸米托蒽醌注射液1 mL，置同一10 mL棕色量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，用0.22μm滤膜过滤，续滤液作为加标供试品溶液。

取上述溶液分别进样分析，记录色谱图见图2。可见，空白溶剂溶液、空白辅料溶液在焦亚硫酸钠出峰处无干扰，符合要求，专属性良好。

图2 专属性试验色谱图Figure 2 Chromatogram of specificity

2.3.3 标准曲线与线性范围 取“2.2”项下的对照品储备液，逐级稀释，制成质量浓度分别为0.101 7、1.017 0、3.051 0、5.085 0、8.136 0、10.170 0、12.204 0、15.255 0、20.340 0μg/mL的溶液作为系列对照品溶液。按“2.1”项色谱条件进样测定，同时记录色谱图。以样品浓度（X,μg/mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，结果显示焦亚硫酸钠在0.101 7~20.340 0μg/mL范围内线性关系良好，标准曲线为Y=0.077 5X-0.046（r=0.998）。

2.3.4 定量限与检测限 精密量取“2.3.3”项下的系列对照品溶液，逐级定量稀释，进样并记录色谱图，定量限（LOQ）以信噪比为10∶1的浓度进行计算，检测限（LOD）以信噪比为3∶1的浓度计算。结果得焦亚硫酸钠的定量限为0.10μg/mL，检测限为0.05μg/mL。

2.3.5 重复性试验 按“2.2”项方法配制供试品溶液6份，精密量取供试品溶液1.00 mL，置10 mL棕色容量瓶中，分别精密加入焦亚硫酸钠标准溶液（100.1μg/mL）1.00 mL共6份，再按照供试品溶液制备方法制备，即得100%限度加标供试品溶液。供试品溶液和100%限度加标供试品溶液分别按“2.1”项下色谱条件进样测定，按外标法以峰面积计算焦亚硫酸钠的含量。结果表明，6份供试品溶液未检出焦亚硫酸钠，6份100%限度加标供试品溶液焦亚硫酸钠的平均质量浓度为9.04μg/mL，RSD为2.1%（n=6），表明方法重复性良好。

2.3.6 稳定性试验 按“2.2”项下配制对照品储备液，再稀释成质量浓度为10μg/mL的对照品溶液，按“2.2.5”项下配制100%限度供试品溶液，于室温放置0、4、8、12、24、36 h后进样分析，记录峰面积，分别计算对照品溶液、100%限度供试品溶液放置不同时间后主峰峰面积与0时峰面积的RSD值，结果见表2。

表2 溶液稳定性试验结果Table 2 Results of solution stability tests

结果表明，对照品溶液、100%限度供试品溶液在室温下放置8 h，主峰峰面积与0时峰面积的RSD值＜2%，放置12 h后RSD值＞2%，表明焦亚硫酸钠对照品溶液及100%限度加标供试品溶液在室温下存放8 h时稳定性良好。

2.3.7加样回收率试验 精密量取盐酸米托蒽醌注射液1.00 mL，置10 mL棕色量瓶中，共9份，分别精密加入焦亚硫酸钠对照品溶液（100.1μg/mL）0.80、1.00、1.20 mL各3份，按“2.2.4”项方法制备供试品溶液，即得80%、100%、120%3个浓度的回收率样品溶液，注入离子色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算焦亚硫酸钠的含量，计算回收率和相对标准偏差，结果见表3。

表3 焦亚硫酸钠加样回收率试验结果Table 3 Results of recovery tests of sodium pyrosulfite(n=9)

可见，9份焦亚硫酸钠的回收率范围为90.12%~92.69%，满足90%~108%要求，RSD为1.1%，小于6.0%，符合要求，表明方法准确度良好。

2.3.8 样品检测 取10批自制盐酸米托蒽醌注射液（011190801、011190802、011190803、011190804、011190805、011190806、011190901、20180101、20180102、20180103）各2份，及1批参比制剂诺肖林（P00033S），按“2.2”项方法配制供试品溶液，按“2.1”项色谱条件进样测定，其中9批自制样品及参比制剂中均未检测出焦亚硫酸钠，1批自制样品中焦亚硫酸钠质量浓度为6.45 ng/mL，RD为0.0%（n=2），表明成品中焦亚硫酸钠仅残留微量或无残留，自制样品与参比制剂一致。

3 讨论

本研究通过KOH淋洗液梯度洗脱的方式建立了测定盐酸米托蒽醌注射液中痕量抗氧剂焦亚硫酸钠含量的离子色谱方法，该方法具有较高的专属性、准确性和重现性。本文方法中焦亚硫酸钠的检测限为0.05μg/mL，定量限为0.10μg/mL，分别为按处方组成折算供试品溶液理论含量10μg/mL的0.5%、1%，方法灵敏度满足测定要求。因供试品中未检出焦亚硫酸钠，仅用供试品不能确定考察方法的重复性和稳定性，故方法学考察时平行对比加入处方量焦亚硫酸钠的100%限度加标供试品溶液的测定结果；另外，采用100%限度供试品溶液考察流速（1.0±0.1）mL/min条件对试验结果的影响，测得该流速条件下样品中焦亚硫酸钠含量的RSD为2.0%，表明流速的微小变动对测定结果影响较小，方法耐用性良好。

盐酸米托蒽醌较易被氧化，焦亚硫酸钠作为抗氧剂，在生产过程中保护盐酸米托蒽醌不被氧化，成品检测结果显示焦亚硫酸钠仅残留微量或无残留。经盐酸米托蒽醌注射液稳定性试验考察，焦亚硫酸钠的处方量达到使用目的，且无论是焦亚硫酸钠残留量或成品稳定性趋势均与参比制剂一致。焦亚硫酸钠溶于水，久置空气中，则氧化成硫酸钠，参考文献[12]采用0.2%甲醛溶液作为溶剂，能起到抗氧化作用，提高供试品溶液稳定性，保证测定准确。

本研究所建方法可准确测定盐酸米托蒽醌注射液中抗氧剂焦亚硫酸钠的含量，适用于该品种中焦亚硫酸钠残留量的控制。