磷脂酶A2在子宫内膜异位症中的表达及临床意义

徐福霞

(天津市静海区医院妇科，天津 301600)

子宫内膜异位症是妇科中一种较难治愈的疾病[1]，多种研究表明该病是一种与炎性反应、免疫有关的疾病，其与腹腔微环境及机体的炎性密切相关[2]。COX为一种膜结构蛋白，是炎性过程中重要的诱导酶，与炎性形成有关，大量的炎性细胞因子、生长因子、癌基因、低氧、脂多糖和肿瘤启动子等均能诱导COX-2的表达。研究发现内异症患者体内COX-2表达增加，COX-2基因在内异症在位、异位子宫内膜中均存在高表达，且COX-2可诱导EMs中子宫内膜细胞的增殖，抑制细胞凋亡，促进血管生成[3]。前列腺素(PG)是一种半衰期极短的不稳定型类花生四烯酸化合物(AA)，在生物体内含量极微而活性极强，具有广泛的生理和病理作用。有研究表明伴有盆腔痛症状的内异症患者异位病灶COX-2、PGE2表达水平明显升高，且腹腔冲洗液PGE2浓度也明显升高[4]。COX-2的过表达及伴随的PGs升高可能使子宫内膜处于一种异常状态，加上巨噬细胞等免疫细胞分泌的致炎因子对腹膜的损伤，为其种植提供良好环境。磷脂酶A2(PLA2)是一类转变膜磷脂为花生四烯酸并随后生成二十碳酸类炎性介质的重要酶类，AA分别经环氧化酶和脂氧酶途径生成前列腺素。

1 资料与方法

1.1一般材料：选取2016年3月～2020年2月天津市静海区医院腹腔镜手术并经术后病理确诊为子宫内膜异位症的患者，取病变最典型部位为研究标本，共22份，按手术所见分型为：卵巢型14例，腹膜型2例，盆底深部浸润型6例。按照美国生育协会修正分期法(R-AFS)对患者进行临床分期，其中Ⅰ期～Ⅱ期11例，Ⅲ期～Ⅳ期11例。该组年龄20～50岁，平均(33.6±9.2)岁，术前除外合并急慢性盆腔炎，无药物治疗史，无其他内科合并症，月经规律且非月经期。同时选择同期因卵巢良性畸胎瘤行腹腔镜手术的患者为对照组，共20例，年龄24～48岁，平均(34.8±8.6)岁，该组均为体检发现，排除标准同病例组。本研究设计经过伦理委员会同意，术前征得患者同意并签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1酶联免疫吸附试验(ELISA)检测sPLA2：术中留取内异症组及对照组患者腹腔液或腹腔冲洗液10 ml，室温静置1 h，以3 000 r/min离心3 min后取上清液约1 ml分装，置于-80℃冰箱保存。共采集内异症组标本22份,其中Ⅰ期～Ⅱ期11例，Ⅲ期～Ⅳ期11例；对照组标本20份。采用ELISA检测sPLA2含量。 试剂盒购自福州博科生物科技公司，检测敏感度均为1 pg/ml，严格按照试剂盒说明书操作。

1.2.2免疫组化法检测cPLA2：术中留取组织标本经生理盐水冲洗后，部分4%甲醛溶液固定,石蜡包埋，4 μm厚的连续切片；部分置-80℃冰箱保存行Western blot检测。采用HE染色观察组织结构，免疫组化SP法进行免疫组化检测，兔抗人cPLA2多克隆抗体购自美国immunoway公司，染色步骤按SP试剂盒说明书进行，一抗、二抗滴度均为1∶200，阴性对照用PBS代替一抗，DAB进行染色。在异位病灶的子宫内膜和血管内皮细胞细胞质上出现棕色颗粒样物质的细胞为阳性。取组织标本，加入RIPA裂解液裂解，冰上孵育20 min，13 500 r/min 离心20 min，收获蛋白，根据BCA法蛋白定量测定蛋白浓度。十二基甲酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)恒压110 V电泳分离，转移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)，5%脱脂奶粉封闭2 h，一抗(1∶500兔抗人cPLA2多克隆抗体)4℃冰箱中过夜，TBST稀释的二抗37℃摇床2 h，化学发光底物显色。将胶片进行扫描，对目的条带行灰度扫描分析，测得的灰度值与actin蛋白条带灰度值的比值作为蛋白相对表达量，进行半定量分析。

2 结果

2.2sPLA2在内异症患者中的表达：sPLA2在内异症组和对照组中表达水平分别为(818.8±325.6)ng/L和(545.4±243.3)ng/L，内异症组显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1A；内异症Ⅲ期～Ⅳ期和Ⅰ期～Ⅱ期患者sPLA2分别为(687.4±279.9)ng/L和(950.2±327.3)ng/L,Ⅲ期～Ⅳ期显著高于Ⅰ期～Ⅱ期，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1B。

图1 sPLA2在内异症患者中的表达

2.2cPLA2在内异症患者中的表达：cPLA2主要表达于异位子宫内膜组织，定位于子宫内膜腺体上皮细胞及血管内皮细胞胞浆，阳性表达呈棕黄色颗粒。见图2。

2.3sPLA2诊断内异症价值：以腹腔液中sPLA2为参考，诊断内异症的敏感性和特异性分别为75.0%(50.9%～91.34%)和80.0%(56.34%～94.27%)， ROC曲线下面积为0.76(0.61～0.92)，见图3A。sPLA2鉴别诊断Ⅲ期～Ⅳ期和Ⅰ期～Ⅱ期内异症敏感性和特异性分别为80.0%(44.39%～97.48%)和70.0%(34.75%～93.33%)，见表1。ROC曲线下面积为0.73(0.49%～0.96%)，见图3B、表1。

图2 cPLA2在盆底异位病灶和卵巢子宫内膜异位囊肿血管中的表达

图3 sPLA2诊断内异症价值

表1 sPLA2诊断内异症及对分期的预测价值

3 讨论

内异症在某一阶段从临床上抑或病理上可表现为一种炎性过程，而研究证明PLA2在炎性反应发展中起重要作用[5]。在COX-2和脂氧化酶作用下，AA可生成PGs、白三烯等炎性活性物质参与机体的一系列生理病理过程启动炎性反应，引起机体多种疾病。Sano[6]等研究发现PLA2在内异症患者腹腔液中表达升高，Sahmani等[7]研究也表明sPLA2在内异症患者体内表达升高，提示PLA2在内异症发病中起到重要作用，但PLA2在内异症中发挥的作用在国内尚未见研究。

sPLA2是磷脂酶A2家族中的一种，其表达在炎性反应的效应细胞如中性粒细胞、巨噬细胞和肥大细胞等，当机体受到细菌等微生物侵袭或发生自身免疫性疾病时，sPLA2会被白细胞等含有sPLA2的细胞大量地分泌到细胞外液中，并与白细胞相互作用，共同参与炎性反应和发挥杀菌作用[8]。本研究结果表明，随着内异症病情的进展，sPLA2值明显升高，提示sPLA2可能作为一种炎性介质，在内异症的活动中起促进作用。

cPLA2与sPLA2两者相互作用可促进炎性反应中AA的大量出现，在同时表达cPLA2和sPLA2细胞中，AA的大量产生受sPLA2的调控，而sPLA2的作用在某种程度上取决于cPLA2的活化，实验证明在肥大细胞及中性粒细胞中，外源的sPLA2产生的细胞内信号可诱导cPLA2活性；在巨噬细胞及其他免疫细胞中，sPLA2分泌的AA受到cPLA2的调节[9]。本研究结果显示Ⅲ期～Ⅳ期内异症患者体内cPLA2表达水平显著高于Ⅰ期～Ⅱ期，与腹腔液中sPLA结果一致，由此可以设想在内异症患者体内两者相互诱导共同作用，对内异症病情的进展起到重要作用，具体机制需进一步探讨。

本研究结果提示腹腔液中sPLA2升高，并与疾病进展有关。以sPLA2为参考诊断内异症及对内异症分期有较高的诊断敏感性和特异性，可作为临床应用的生物学指标。