一测多评法同时测定蛹虫草中5种核苷类成分的含量

赵磊，赵艳，马彧※，姜大成

（1.长春中医药大学药学院，吉林 长春 130117；2.四平市食品药品检验所，吉林 四平 136000）

蛹虫草（Cordyceps militaris）又称为北虫草、北冬虫夏草，隶属于真菌界麦角菌科（Clavicipitaceae）虫草属，是世界性广布种，我国各省区均有分布。人工蛹虫草为从天然蛹虫草[Cordyceps militaris（L.et.Fr.）Link]中分离得到的菌种拟青霉（Paecilomyces militaris）经人工培养所获得的子实体[1]。蛹虫草性平，味甘，归肺、肾经，有补肺益肾的功效，用于痨嗽痰血、自汗、盗汗、阳痿、遗精、腰膝酸痛及乏力等[2]。蛹虫草和冬虫夏草化学成分具有较大的相似性，含量较高的成分有尿苷、鸟苷和腺苷，还含有虫草素和N6-（2-羟乙基）腺苷等特有核苷类成分[3,4]。N6-（2-羟乙基）腺苷具有抗肿瘤和改善睡眠等作用，虫草素具有抗肿瘤和调节免疫等作用[5]。目前，蛹虫草无国家标准，地方标准辽宁省中药材标准第二册（2019年版）及吉林省中药材标准第二册（2019年版）有收载，测定成分均为虫草素[6,7]。通过实验测定尿苷、鸟苷、腺苷、虫草素和N6-（2-羟乙基）腺苷是蛹虫草中含量最高的成分。

“一测多评法”为测定某个代表性成分作为一种对多指标质量控制的有效方法[8-12]，本实验采用以腺苷作为内标物为对照品，建立其他4种核苷类的的相对校正因子进行含量计算，并进行方法学考察，用以验证QAMS法在蛹虫草多指标质量控制中优势[13-17]。

1 实验方法

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：1260型，配二极管阵列检测器，美国安捷伦科技有限公司；高效液相色谱仪：LC-2010型，配二极管阵列检测器，日本岛津公司；高效液相色谱仪：2695型，配二极管阵列检测器，沃特世公司；电子天平：QUINTIX313-1CN型，分度值为万分之一，Sartorius公司；电子天平：MSE125S型，分度值为十万分之一，Sartorius公司；超声波清洗器：KQ-500DV型，江苏昆山市超声仪器有限公司；去离子水发生器：Milli-Q型，密理博公司。

蛹虫草药材购自广东、江西、浙江、天津规定样品编号为（YP1~YP8），经赵磊副主任药师鉴定为蛹虫草（Cordyceps militaris）；尿苷（批号110887-200202）、鸟苷（批号111977-201501）和腺苷（批号110879-200202）由中国食品药品检定研究院提供；虫草素（批号110858-201503）和N6-（2-羟乙基）腺苷（批号H29A7R13918）由上海源叶生物技术有限公司提供，纯度≥98.0%；甲醇和乙腈为色谱纯，Fisher公司；水为超纯水。

1.2 溶液的制备

1.2.1 混合对照品溶液精密称取5种核苷类对照品适量，加20%甲醇制成每1 mL含尿苷、鸟苷、腺苷、虫草素和N6（-2-羟乙基）腺苷分别为246.0g、237.5g、257.0g、251.5g和249.0g的标准母液。分别取对照品母液适量，加20%甲醇继续稀释成24.60g、23.75g、25.70g、25.15g和24.90g浓度的标准品溶液。

1.2.2 供试品溶液的制备 精密称取0.2 g的蛹虫草样品粉末，精密加入10mL的20%甲醇超声处理30min，超声后补重处理，取续滤液，即得。

1.3 色谱条件与系统适用性

图1 混合对照品（A）及蛹虫草样品（B）高效液相色谱图Fig.1 HPLC of the mixed reference substance(A)and cordyceps militaris sample(B)

2 结果

2.1 线性关系考察

精密吸取各对照品母液0.1mL、0.2mL、0.5mL、1.0mL及2.0mL置于10 mL量瓶中，稀释至刻度，作为待测混合对照品溶液，进样量各5L，注入液相色谱仪，测定，以各混合对照品的质量浓度（g mL-1）作为横坐标，以色谱峰的峰面积为作为纵坐标，绘制标准曲线，结果见表1。

表1 各被测成分的标准曲线方程、线性范围和相关系数Table 1 The standard curve equation,linear range and correlation coefficient of each measured component

结果表明5种核苷类成分在相应线性范围内线性关系良好。

2.2 重复性试验

取同一批样品粉末（YP1）6份，每份0.2 g，精密称定，按照供试品溶液制备方法制备，采用上述色谱方法进行测定，计算含量。结果5种核苷类的测定结果RSD（n=6）均小于1.02%，表明重复性良好。

2.3 稳定性试验

2.4 加样回收率试验

取（YP1）样品粉末6份，取样量约0.1 g，精密加入1mL的质量浓度分别为62.5g mL-1、51.2g mL-1、82.5g mL-1、130.3g mL-1和71.5g mL-1的尿苷、鸟苷、腺苷、虫草素和N6（-2-羟乙基）腺苷对照品溶液，每份分别精密加入20%甲醇5 mL，进行测定，计算回收率。结果样品中尿苷、鸟苷、腺苷、虫草素和N6-（2-羟乙基）腺苷平均回收率（n=6）均在97.35%~101.25%范围内，RSD分别小于1.86%。说明回收率良好。

2.5 校正因子重现性考察

2.5.1 HPLC色谱仪及色谱柱考察试验考察采用安捷伦1260型、岛津LC 2010AHT型和Waters 2695型3台液相色谱仪。采用色谱柱为Waters ACQUITY HSS T3 C1（84.6 mm 250 mm,5m）、岛津InertSustain AQC1（84.6 mm 150 mm,5m），安捷伦ZOBAX SB-AQ柱（4.6 mm 150 mm,5m）考察相对校正因子：相对校正因子的公式为：

式中As为待测成分s的峰面积，Cs为质量浓度；Ai为内参物i的峰面积，Ci为质量浓度，结果见表2。结果表明，在不同的色谱柱及高效液相色谱仪中具有较好的重现性，能够用于尿苷、鸟苷、腺苷、虫草素和N6-（2-羟乙基）腺苷的含量测定。

表2 不同HPLC色谱仪及色谱柱测得的相对校正因子Table 2 relative correction factors measured by the different HPLC chromatographs and columns

2.5.2 5种核苷类色谱峰的定位采用5种待测成分间的相对保留值（待测成分与内参物调整保留时间之比）作为定位标准，并在不同HPLC色谱仪、不同厂家的色谱柱进行考察。通过实验表明，在采用节省标准物质的情况下，利用相对保留值进行色谱峰定位，可采用内标物的保留时间，结合其他色谱峰在260 nm下的紫外吸收特征及相对保留值，可以确定需要测定峰的位置。因此选用相对保留值这一参数作为蛹虫草中尿苷、鸟苷、腺苷、虫草素和N6-（2-羟乙基）腺苷目标色谱峰的定位指标比较合理。结果表明，不同仪器和色谱柱下各成分间的相对保留值波动较小，RSD在1.20%~3.20%，见表3。

表3 不同HPLC色谱仪器与色谱柱下目标成分的相对保留值Table 3 Relative retention values of target components under different HPLC chromatographic instruments and chromatographic columns

2.6 一测多评法与外标法的结果比较

取蛹虫草约0.2 g，精密称定，按供试品溶液制备方法及上述色谱条件进行测定，采用外标法和一测多评法计算蛹虫草中尿苷、鸟苷、腺苷、虫草素和N6-（2-羟乙基）腺苷含量，见表4。采用SPSS19.0软件分析两种方法的尿苷、鸟苷、虫草素和N6-（2-羟乙基）腺苷含量之间的Pearson系数，实验结果说明两法所测的含量相似度极高，QAMS法在蛹虫草中核苷中的应用是可行的。两种方法所得的各批次药材的含量间的相对标准偏差亦在3%以内，表明测定方法上不存在显著性差异。

表4 QAMS及外标法测定蛹虫草中5种核苷的含量（n=2,mg·g-1）Table 4 Determination of five nucleosides in Cordyceps militaris by QAMS and the external standard method(n=2,mg·g-1)

3 讨论

3.1 供试品溶液制备方法的选择

考察了水、20%、50%和100%的甲醇作为提取溶剂，含量结果差别不大，但色谱峰形有差异，选择20%甲醇作为提取溶剂效果最佳。提取时间采用超声20min、30 min和40 min，结合文献及实验结果30 min提取效果最佳。

3.2 波长的选择

对5种测定成分经二极管阵列检测器分析，因5种化合物均为核苷类成分，结构相似，其紫外吸收峰相似，5种核苷类的吸收波长分别在254~268 nm之间，结合实验测定及文献考量，选用260 nm作为测定波长。

3.3 校正因子的考察

为了验证所建立的尿苷、鸟苷、腺苷、虫草素和N6-（2-羟乙基）腺苷成分的一测多评法的适用性及可行性，本研究进行了方法学考察以及系统适用性试验。通过在3台液相色谱仪和3个不同品牌及型号的色谱柱的考察，结果表明尿苷、鸟苷、虫草素和N6-（2-羟乙基）腺苷含量与腺苷之间的相对校正因子具有良好的重现性。本研究首次将一测多评法应用于蛹虫草的质量评价中，该法所得5种主要核苷类成分含量与外标法所测得含量之间没有显著性差异，说明一测多评法可作为蛹虫草质量控制的有效方法之一，并具有简便、准确、成本较低的优点。QMAS法与外标法对测定的结果进行数据比较，发现一测多评法更具有测定优势。