强脊方对强直性脊柱炎患者Th17细胞及相关因子IL-6、IL-23影响的临床研究*

李江 徐斌 乔治 谭龙旺

(1.陕西中医药大学附属医院，陕西 咸阳 712000;2.西安市第五人民医院，陕西 西安 710000)

强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)是一种类风湿因子阴性，以脊柱僵硬并逐渐强直畸形为特征，逐渐发展累及其他关节，甚至累及眼、肺、肾脏等器官及心血管系统，最后导致功能障碍的一种免疫性疾病。目前越来越多的研究表明[1]，Th17细胞在AS发病中的作用不容忽视。Th17细胞是近年发现的一群产生IL-17的辅助性T细胞，通过分泌IL-17、IL-6、IL-21、IL-22、IL-23、TNF-α等多种细胞因子促进炎症、参与抗感染免疫、参与组织损伤和炎症性骨破坏。

杨毓华教授经40年临床经验总结，所拟中药方强脊方治疗强直性脊柱炎患者，疗效显著，为进一步探讨分析方药疗效机理，设计此临床试验，并与柳氮磺吡啶进行疗效对比，为临床推广提供理论依据。

1 对象与方法

1.1研究对象 AS患者40例，来自2018年6月—2019年6月陕西中医药大学附属医院骨科与西安市第五人民医院(西安风湿病研究所)风湿科门诊患者。患者按照来诊时间排序分为两组，每组20例，单号患者为验方中药组，双号患者为柳氮磺嘧啶对照组。所有对象均对本研究知情同意并签署知情同意书，活动度ASDAS<2.1为稳定期、ASDAS≥2.1为活动期。本实验主要以稳定期为研究对象。

1.2AS诊断标准 所有入选的强直性脊柱炎患者均按1984年修订的纽约标准进行诊断[2]。

1.3纳入标准 ①年龄18～65岁；②病程>3个月；③符合1984年修订的AS纽约分类标准；④就诊前1个月未使用过糖皮质激素，6个月内未使用过DMARDs。

1.4排除标准 ①妊娠期或哺乳期妇女；②合并有严重心、肝、肾等重要脏器和血液、内分泌系统病变；③合并有恶性肿瘤或者其他风湿性疾病的患者；④精神病患者；⑤正处于急、慢性感染期患者；⑥活动度评分ASDAS≥2.1的活动期患者。

1.5临床指标检测 测定AS组治疗前的实验室指标：①强直性脊柱炎疾病活动度评分分值的计算；②CRP；③ESR；④HLA-B27。

1.6研究方法 对照组:患者给予柳氮磺吡啶肠溶片(信谊，上海福达制药有限公司，国药准字H31020840，0.25 g×12 s×5板)开始0.25 g，日3次，以后每周增加0.25～1.0 g，日3次，维持2周，从第6周每周减0.25 g，第8周恢复0.25 g，日3次，维持2月。

中药组:中药丸剂口服，每日2次，每次2丸。具体方剂如下:当归12 g，萆薢15 g，红花20 g，白芷10 g，制南星10 g，制川乌6 g，制草乌6 g，薏苡仁15 g，细辛6 g，地龙6 g，狗脊30 g，葛根30 g，牛膝20 g，赤芍30 g，白芍30g杜仲15 g，淫羊霍15 g，五加皮15 g，三七15 g，干胎盘1个 蚂蚁200 g，与蜂蜜制作为蜜丸，约180丸，每日2次，每次2丸，黄酒送服，维持2月。所有药物由本院药剂室制作。

1.7分析指标 对中药组和对照组所有患者治疗前后进行强直性脊柱炎疾病活动度评分，C反应蛋白、血沉、HLA-B27检测，观察两组患者临床疗效。对所有病例治疗前进行抽血采样，流式细胞术检测Th17细胞数量；酶联免疫吸附法检测相关细胞因子IL-6、IL-23。治疗2月后再次进行抽血采样，组间进行标本对比分析。

2 实验方法

2.1标本制备 对照者均于早晨8～9点间空腹采血。抽取2 mL于EDTA抗凝管中及4 mL于肝素钠抗凝管中。①EDTA抗凝血2 mL，于3000 r/10 min离心后收集血清冻存于-80 ℃，用于ELISA检测IL-6、IL-23细胞因子。②肝素钠抗凝血4 mL，用于流式细胞术检测Th17细胞数量。

2.2收集外周血单核细胞及血浆 步骤方法：抽取研究对象外周静脉血5 mL于ETDA抗凝采血管内；在15 mL离心管中加入4 mL淋巴细胞分离液并将外周血缓缓倒入离心管内(采血6小时之内)，2000转/分离心20分钟；吸出上层血浆和中间层PBMCs(外周血单核细胞)；血浆置于-80 ℃冰箱保存，PBMCs用于流式细胞术检测。

2.3实验室检测 流式细胞术检测Th17细胞，过程如下：

①调整细胞PBMCs浓度至2×106/mL，取2 mL PBMCs悬液接种于6孔培养板后加入终浓度为25 ng·mL-1的佛波醇乙酷(PMA),1 μg·mL-1的离子霉素(ionomycin)和1.7 μg·mL-1的蛋白质转运抑制剂莫能霉素(monesin)，在37 ℃,5% CO2细胞培养箱培养5 h。

②用PBS洗，离心收集细胞，加入5 μL FITC标记的鼠抗人CD4单抗，避光孵育15分钟。

③加入50 μL固定液((A液)室温避光固定反应15分钟后加入3 mL PBS,混匀后离心弃上清。

④加入50 μL破膜剂(B液)进行细胞打孔利于细胞因子单抗进入细胞，进行胞内细胞因子染色。

⑤加入5 μL PE标记的IL-17单克隆抗体, 4 ℃避光孵育15～20分钟，再用0.5 mL PBS重悬细胞，上机检测。

⑥检测前常规对流式细胞仪进行光流路质量调控和荧光补偿，使仪器各项指标在质量控制允许值范围，检测时首先根据前向(FSC)和侧向(SSC)散射光信号对淋巴细胞群进行设门，每份标本获取设门内细胞在10000个以上，数据分析使用EXP032软件。

2.4统计学方法 Epi data 3.0软件建立数据库，采用SPSS 19.0统计软件进行结果分析，如资料符合正态分布，采用两组独立样本t检验，不符合正态分布采用非参数检验，两变量之间的相关性采用Pearson相关分析，P<0.05为有统计学意义。

3 结果

所有AS患者中，中药组有15名患者，对照组有13名患者配合完成全部实验测试，其外周血进行流式细胞术检测Th17细胞。Th17细胞检测选取的抗体是CD4与IL-17+，所以CD4+、IL-17+的细胞被确认为Th17细胞。流式细胞仪检测结果表明：AS患者经治疗后CD4+、IL-17+细胞(即Th17细胞)均显著减少，且中药组与对照组相比较，二者无明显差异(P>0.05)，如图1、图2示。

图1 治疗前CD4+、IL-17+细胞流式检测图

图2 治疗2月后CD4+、IL-17+细胞流式检测

研究对象的一般临床指标检测情况显示，治疗前后两组患者的活动度评分(ASDAS)，C反应蛋白、血沉各项指标均明显下降(P<0.05)，并且两组之间无明显差异(P>0.05)，其中中药组有2例患者HLA-B27转为阴性，对照组有一例转为阴性。酶联免疫吸附法检测两组患者相关细胞因子治疗前后水平如下表1。结果显示两组均可以有效降低IL-6、IL-23，但二者无明显差异(P>0.05)。

表1 两组治疗前后相关细胞因子水平差异

4 讨论

目前AS的发病机制尚不清楚，但机体的免疫功能异常在该病发病中的作用已经得到了肯定，T细胞的免疫功能异常更是得到了广泛的重视[3]。CD4辅助性T细胞作为T细胞中的一个重要群体因分泌的细胞因子不同而被分为多个亚群，各个Th细胞亚群在自身免疫疾病发病中的作用在近十年中得到了广泛的研究，关于Th细胞各亚群之间的失衡在一些自身免疫疾病的发生发展的作用也得到了肯定[4]。大量研究[5-7]证实了AS患者外周血中Th17与Treg细胞的不平衡可能参与了AS的发病和病变进展。在AS患者外周血中微小核糖核酸-155(miR-155)表达水平可能影响Th17/Treg细胞平衡状态[8]。Th细胞根据其功能和分泌的细胞因子分为不同的亚群，主要的Th细胞亚群有：Th1，Th2，Th17及Treg四种[9]。

Th17作为近几年一种新发现的Th细胞亚群，在适应性免疫应答中起着十分重要的作用。Th17细胞因分泌IL-17而得名，除了分泌IL-17以外，Th17细胞还分泌IL-6、IL-23等细胞因子，其主要效应功能是在对外来的细菌和真菌的免疫应答中活化中性白细胞，进一步介导炎症反应。初始的CD4+分化为Th17细胞所需要的条件是：局部微环境中的IL-6、TGF-β和IL-23；转录因子RORγt的激活[10]。有人对IL-6在AS中的诊断价值进行了评测，发现诊断灵敏度为62.5%，特异度为92.5%[11]，可作为AS患者早期诊断及评判疗效的参考。

中医在治疗本病方面积累了丰富的经验，一些固定成方、验方和单方的应用更是百花齐放，达到祛除病痛，调节免疫的作用，且可避免或对抗西药的毒副作用。中药内服是治疗AS的常用方法，治疗本病常以补益肝肾、活血通络、祛风湿强筋骨为主，配以其他药物，辨证施治，临证加减[12]。也有一些中成药在临床上取得明确疗效[13-15]。

现代医学对中药治疗AS也有了大量研究，证实苦参碱及雷公藤甲素抑制Th17分化，可能是治疗AS炎症的有效药物之一[16]。谭希运用HPLC(高效液相色谱法)分析了补肾强督治偻方有效化学成分，证明存在川芎嗪，芍药苷、柚皮苷、蛇床子素和熊果酸五种化合物，其有效成分对LPS(脂多糖)诱导的RAW264.7(小鼠单核巨噬细胞)细胞模型的IL-23/Th17炎症轴有不同的影响，如熊果酸和川芎嗪也可以抑制RAW264.7模型细胞NO和TNF-ɑ、IL-6、IL-17、RORγt、IL-23的表达，且对细胞增殖无影响[17]。目前临床上也有大量的中西医结合治疗AS的报道，如口服药物、针灸、中药熏蒸等联合西医常规药物，取得了一定疗效，并且取长补短，相辅相成[18-20]。

杨毓华教授经多年临床经验所拟强脊方治疗AS患者，临床效果显著，通过此实验证实它能通过降低Th17细胞的表达数量，减少IL-6、IL-23细胞因子分泌，改善炎症反应，与柳氮磺吡啶疗效相当，避免了西药的毒副作用，值得临床推广。