山里红总黄酮超声提取及抗氧化活性研究

杨艳俊，杨秀东，张 艳

(吉林化工学院 化学与制药工程学院，吉林 吉林 132022)

山里红(Crataegus pinnatifida Bge.var.major N.E.Br.)是中国药典中山楂药材的两种来源品种之一，属于蔷薇科果树的果实，也称为北山楂、仙果，广泛分布于中国北方，属于天然的有机食品，重要的药食同源之物[1].山里红干燥成熟的果实，有活血化瘀、理气通脉、化浊降脂的功能.山里红中有许多类型的生物活性成分，主要分为两大类：黄酮类和有机酸.已经分离出金丝桃苷素、槲皮素、牡荆素等黄酮类化合物[2-6].黄酮类化合物具有较强的扩张冠状动脉、改善微循环的功效，较好的抗氧化能力，同时能够抵抗动脉粥样硬化，改善细胞糖脂代谢等作用[7-11].因此，山里红总黄酮的研究开发具有重要的经济和社会效益.以山里红的干燥果实为研究对象，应用BBD实验设计优化超声辅助提取工艺，采用紫外-可见分光光度法测其含量，通过清除超氧阴离子、DPPH自由基、ABTS自由基的清除能力来评估抗氧化活性，为山里红的深入开发奠定基础.

1 实验部分

1.1 实验试剂与仪器

野生山里红干燥果实，吉林市周边山区采集；芦丁标准品，95%乙醇，三氯化铁，镁粉，亚硝酸钠，硝酸铝，氢氧化钠，三羟甲基氨基甲烷，浓盐酸，邻苯三酚，DPPH，ABTS，过硫酸钾，以上均为国产分析纯.

紫外分光光度计，北京普析通用仪器有限公司；电子分析天平，上海舜宇恒平科学有限公司；旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；恒温水浴锅，常国华电器有限公司；超声仪，昆山市超声仪器有限公司；电热恒温鼓风干燥机，上海姚氏仪器设备厂；高速粉碎机，永康市铂欧五金制品有限公司.

1.2 实验方法

1.2.1 总黄酮的鉴定

山里红提取液，加入FeCl3溶液，溶液变为深绿色；另取提取液加入少许的镁粉，摇匀，加入2滴浓盐酸，1～2 min后，溶液呈紫色，证明提取液含有黄酮类化合物.

1.2.2 标准曲线的绘制

(1)对照品溶液的制备

精密称取10 mg芦丁标准品置于50 mL容量瓶中，用80%乙醇溶解并定容，得0.2 mg·mL-1标准品溶液.

(2)供试品溶液的制备

烧瓶中加入山里红粉末2.0 g，40 mL 60%乙醇溶液，在30 ℃下超声提取30 min，过滤，得黄酮提取液，备用.

(3)测定最大吸收波长

取供试液1 mL置于25 mL容量瓶中，加少量5%的NaNO2溶液，摇匀，静置6 min；加10%的Al2(NO3)3溶液0.3 mL，摇匀，静置6 min；加4%的NaOH溶液4 mL，60%乙醇定容至刻度，在400～600 nm波长处进行扫描，在504 nm处有最大吸收峰.如需测定样品吸光度，则每次测定3个数据取平均值.

(4)绘制标准曲线

通过用梯度浓度标准品溶液测吸光度后，依据所得数据绘制标准曲线.

1.2.3 方法学研究

(1)精密度实验

移取2 mL芦丁标准品溶液并放进10 mL容量瓶中，按照1.2.2(3)项显色处理后，在504 nm波长处连续测定6次吸光度，计算相对偏差.

(2)稳定性实验

各吸取少量供试液，使时间间隔分别为5、10、15、30、60、90 min，按1.2.2(3)项显色处理后，在504 nm波长处测得吸光度，计算相对偏差.

(3)重复性实验

各吸取少量供试液分别放入6个小容量瓶中，按1.2.2(3)项显色处理后，在504 nm波长处测定吸光度，计算相对偏差.

(4)加样回收实验

精密吸取上述溶液0.2 mL，并置于10 mL量瓶中，加入芦丁标准品(0.41 mg·mL-1)2 mL.按1.2.2(3)项显色处理后，在504 nm波长处测定吸光度，计算相对标准偏差与回收率.

1.2.4 单因素实验

(1)乙醇浓度对黄酮提取率的影响

精密称取5份山里红粉各2.0 g，以40 mL乙醇溶液作为溶剂，设定乙醇浓度为40%、50%、60%、70%、80%，在30 ℃条件下，超声提取30 min，抽滤得滤液.

(2)液料比对黄酮提取率的影响

(3)提取温度对黄酮提取率的影响

(4)提取时间对黄酮提取率的影响

分别精密吸取上述各滤液0.1 mL，按1.2.2(3)项显色处理后，在504 nm波长处测定吸光度，计算总黄酮提取率.

1.2.5 响应曲面法实验设计

为进一步优化山里红总黄酮的最佳工艺条件，根据Box-Behnken中心组合试验设计原则，对应的4因素3水平的响应面分析工艺参数见表1.

表1 响应面试验因素水平设计

1.2.6 山里红总黄酮抗氧化性研究

(1)超氧阴离子的清除能力测定

参照文献[12]～[13]，取缓冲溶液预热后，分别加入不同浓度的供试品溶液和邻苯三酚溶液，反应后加入8 mol·L-1的盐酸终止反应，在325 nm处测吸光度，为A1；蒸馏水代替邻苯三酚溶液，重复上述步骤，吸光度A0.Vc做对照实验.清除率如公式(1)所示：

(1)

(2)对DPPH自由基的清除能力测定

测定方法参照文献[14]～[15]，将2 mL浓度为0.1 mmol·L-1的DPPH溶液与0.1 mg·mL-1的样品溶液(0.4～2.0 mL)混合，室温避光反应35 min，在517 nm处测定其吸光度Ai；测量不同浓度样品的吸光度Aj.以2 mL乙醇代替样品，与2 mL DPPH混匀，其吸光度A0.

(2)

(3)ABTS自由基清除能力的测定

测定方法参照文献[16]～[17]，将ABTS和过硫酸钾混合，静置过夜(至少12 h)，稀释后使之在734 nm处吸光度为0.7±0.02.样品管中加入0.1 mL黄酮溶液、3.9 mL ABTS工作液，静置6 min，测吸光度A样，移取2 mL无水乙醇，按同样方法处理测定吸光度A0.同法测定Vc清除ABTS自由基的能力.清除率如公式(3)所示：

(3)

2 结果与分析

2.1 标准曲线

以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程为：y=11.054x-0.002，R2=0.999 9，在浓度为0.2～0.8 mg·mL-1范围内，芦丁浓度与吸光度呈良好的线性关系.

2.2 方法学研究结果

2.2.1 精密度实验结果

吸光度值RSD=0.5%<1%，表明精密度良好.

1）冒浆。注浆过程中，要认真观察地表及相邻管线的变化情况，由于浆液的注入引起地层变化，并且封闭强度较低的地方可能会冒出浆液，需要加以堵塞，必要时采用间歇注浆方式，确保浆液有效的注入地层。

2.2.2 稳定性实验结果

结果表明吸光度A随时间改变表现出逐渐减弱趋势，在30 min内样品溶液的吸光度降低不显著，RSD值为1.6%；在60 min内样品溶液吸光度值的RSD值为3.2%，随着时间延长持续降低.结果表明，供试品溶液显色后在30 min内较为稳定.

2.2.3 重复性实验结果

6组吸光度值经计算RSD=0.91%<1%，结果表明方法重复性良好.

2.2.4 回收率实验

5组吸光度值经计算RSD=1.19%<2%，平均加样回收率为98.52%.结果表明：回收率较高，相对标准偏差偏小，该方法准确度较高.

2.3 单因素实验结果

2.3.1 乙醇浓度对黄酮提取率的影响

乙醇浓度对黄酮提取率的影响如图1所示.

乙醇浓度/%图1 乙醇浓度的影响

由图1可见，当乙醇浓度逐步增大，总黄酮提取率呈先增大后减小的趋势.当乙醇浓度为60%时，黄酮类化合物提取率最高.原因可能是60%乙醇的溶液极性与黄酮的极性相当.

2.3.2 液料比对黄酮提取率的影响

液料比对黄酮提取率的影响如图2所示.

液料比(mL/mg)图2 液料比的影响

2.3.3 提取温度对黄酮提取率的影响

提取温度对黄酮提取率的影响如图3所示.

提取温度/℃图3 提取温度的影响

由图3可见，当温度逐渐升高，山里红干燥果实粉末的提取率呈现先增大后减小的趋势.提取温度50 ℃时，提取率达到最高.温度越高越有利于扩散进行，有效成分即可快速渗透到溶剂中，但温度过高时杂质也易溶出.

2.3.4 提取时间对黄酮提取率的影响

提取时间对黄酮提取率的影响如图4所示.

提取时间/min图4 提取时间的影响

由图4可见，当提取时间逐渐增加时，提取率呈现先增大后减小并逐渐平缓的趋势.说明此时黄酮类化合物已经基本提取完全，延长提取时间，提取率增大不明显，可取最佳提取时间为20 min.

2.4 响应面法优化实验数据分析

2.4.1 采用响应面法优化山里红总黄酮提取工艺

响应面实验数据汇总见表2，实验号3、22、26、28、29条件是4因素最佳组合，随机分布于29次响应面优化实验中.剩余实验号为分析实验，用来估算实验误差，对实验结果进行补充优化，最后统一分析进行拟合，得出最优条件.由Design-Expert 8.0.6.1软件处理数据，根据二次回归方程拟合分析，得出多组变量之间的函数关系，多因素组合实验数据见表2，其方差分析结果见表3.回归方程为：

表2 响应面实验设计

表3 回归方程方差分析表

Y=-38.45500+0.51300A+0.71771B+0.11300C+0.85533D-7.18750E-004AB-3.50000E-004AC+7.05000E-003AD-1.68750E-003BC+2.09375E-003BD+2.77500E-003CD6.88333E-003A2-0.014564B2-4.53333E-003C2-0.013471D2

2.4.2 方差结果分析

由表3回归方程方差分析结果可知，模型项P值<0.000 1，表明该模型高度显著；失拟项0.626 1>0.05，说明该模型可信度高.回归模型的决定系数R2为0.981 7，调整型决定系数Adj-R2为0.963 4，说明该模型能够很好地描述此次实验结果.模型预测了乙醇浓度、液料比、提取时间、提取温度对山里红总黄酮提取率效果的影响，由表3可知：A、B、D、AD、CD、A2、B2、C2、D2为显著影响因素.

2.4.3 两因素交互作用分析

响应面对于因素A、B、C、D值所构成的三维空间在二维平面上的等高线图，可直观地反映各因素之间的相互作用，等高线的形状可以反映出交互相的强弱，椭圆形表示两因素交互作用显著，而圆形则与之相反.由响应面三维立体曲线分析可知各个因素对响应面值的影响，例如，乙醇浓度的响应曲面坡度陡峭，表明该因素对于黄酮提取率作用明显[18].液料比、乙醇浓度交互作用，表现为曲面陡峭，表明对其响应值的影响明显.通过软件处理得到响应面分析结果见图5～10.

图6 乙醇浓度与提取时间对总黄酮提取率影响的响应面和等高线

图7 乙醇浓度与提取温度对总黄酮提取率影响的响应面和等高线图

图8 液料比与提取时间对总黄酮提取率影响的响应面和等高线图

图9 液料比与提取温度对总黄酮提取率影响的响应面和等高线图

图10 提取时间与提取温度对总黄酮提取率影响的响应面和等高线图

2.4.4 模型方程的验证试验

2.5 山里红总黄酮抗氧化性研究

2.5.1 对超氧阴离子自由基的清除能力测定

测定山里红总黄酮的抗氧化活性，与Vc做对照，测定结果如下图11.

不同浓度的山里红总黄酮都有抗氧化活性，且随总黄酮浓度的增加，吸光度增大.通过使用SPSS进行模拟计算，山里红总黄酮的IC50=0.36 mg·mL-1，Vc的IC50=0.14 mg·mL-1，通过对比山里红总黄酮样品的IC50与Vc的IC50，发现山里红总黄酮有较强的清除超氧阴离子自由基的能力.

浓度/(mg·mL-1)图11 山里红总黄酮提取液和Vc对超氧阴离子自由基的清除能力

2.5.2 对DPPH自由基的清除能力测定

对山里红总黄酮及Vc的抗氧化活性进行了分析研究，实验结果如下图12.

如图所示，随着山里红总黄酮的浓度增加，其清除DPPH自由基能力逐渐增强.通过SPSS进行模拟计算，山里红总黄酮的IC50=0.05 mg·mL-1，而Vc的IC50=0.01 mg·mL-1时由此可见山里红总黄酮对清除DPPH自由基具有一定的作用.

浓度/(mg·mL-1)图12 山里红总黄酮提取液和Vc对DPPH自由基的清除能力

2.5.3 对ABTS自由基的清除能力测定

对山里红总黄酮及Vc的抗氧化活性进行了分析研究，实验结果如下图13.

浓度/(mg·mL-1)图13 浓度梯度下的总黄酮和Vc对ABTS自由基的清除能力

由图可知，山里红总黄酮及Vc均对ABTS自由基有一定的清除能力，且在一定范围内，随浓度的增大，其清除率增大，呈现较好的量效关系.通过使用SPSS进行模拟计算，山里红总黄酮的IC50=0.35 mg·mL-1，Vc的IC50=0.34 mg·mL-1.通过对比山里红总黄酮样品的IC50与Vc的IC50，发现山里红总黄酮有较强的抗氧化活性.

3 结 论

在单因素实验的基础上，通过响应面分析对山里红总黄酮提取工艺进行优化，总黄酮提取的最佳工艺条件：乙醇浓度62%，液料比26 mL/mg，提取时间21 min，提取温度52 ℃，在此条件总黄酮的提取率预测值为10.19%，验证值为10.13%，预测值与验证值非常接近，说明响应面实验方法用于山里红总黄酮提取工艺优化科学可靠.

山里红果总黄酮具有一定的清除自由基的能力，与总黄酮浓度呈线性关系.超氧阴离子、ABTS和DPPH自由基清除能力的IC50分别为0.36、0.05、0.35 mg·mL-1，均具有显著的抗氧化能力.