长链非编码RNA XIST可能通过miR-22/NLRP3促进喉鳞癌细胞增殖

王剑 周兴玮 何娴

（西南医科大学附属中医医院，泸州 646000）

喉癌是头颈部第二常见的恶性肿瘤，以鳞状细胞癌为主。迄今为止，喉鳞状细胞癌（laryngeal squamous cell carcinomas，LSCC）的发病机制尚未明确，治疗效果也未得到明显改善［1］。长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一种长度大于200个核苷酸、但不具备编码蛋白能力的基因转录产物。越来越多的研究发现，lncRNA与肿瘤的发生发展密切相关［2-3］。WU等［4］发现lncRNA H19在LSCC组织中表达上调，且表达水平与患者生存率呈负相关。上调lncRNA H19可通过miR-148a-3p、DNMT1和DNA甲基化促进LSCC的进展。X染色体失活特异转录本（X inactive specific transcript，XIST）是近年来发现的一种新的lncRNA，WANG等［5］发现，敲除XIST可通过miR-137/Notch-1通路抑制非小细胞肺癌的增殖。ZHANG等［6］发现，XIST可通过miR-497-5p/PDCD4通路促进肝癌细胞的增殖和迁移。由此可见，XIST对调控肿瘤细胞的生物学行为具有重要意义。XIST对LSCC有何影响，既往鲜有报道。miR-22/NLRP3通路对LSCC的发生和发展有重要作用［7］。本研究拟分析XIST对miR-22/NLRP3通路的靶向作用及对人LSCC细胞增殖的影响，旨在探讨XIST在LSCC中的作用，为LSCC的治疗提供潜在靶点。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 组织来源2017年6月至2018年9月西南医科大学附属中医医院收治的LSCC患者34例，其中Ⅰ~Ⅱ期13例，Ⅲ~Ⅳ期21例，入院前均未接受放化疗，行部分或全部喉切除术，术中获得癌组织和癌旁组织样本各34例。将组织储存于-70℃下保存。

1.1.2 实验细胞及动物来源人LSCC细胞系Hep-2细胞和HEK293T细胞购于武汉普诺赛生命科技有限公司，培养于含10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素溶液的RPMI1640培养基中，培养环境为37℃、5%CO2。荧光素酶检测实验用HEK293T细胞，其他实验用Hep-2细胞。24只BALB/c雌性小鼠（6周龄）购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号为：SCXK（京）2006~2009，用于后续动物实验。

1.1.3 实验试剂含10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素溶液的RPMI1640培养基（上海联合赛尔生物工程有限公司）；Trizol试剂盒（上海名劲生物科技有限公司）；Lipofectamine2000（美国英杰生命技术有限公司）；CCK-8试剂盒（北京智杰方远科技有限公司）；微孔板阅读器（德国耶拿分析仪器股份公司）；一抗、二抗（美国Invitrogen公司）；pmirGlO双荧光素酶miRNA靶向表达载体（美国Sigma公司）；miR-22 mimic、miR-22 inhibitor、阴性对照（miR-NC）均由上海伯易生物科技有限公司合成；RT-PCR引物序列由上海生工生物工程技术服务有限公司设计并提供。

1.2 方法

1.2.1 荧光定量PCR（RT-PCR）检测Trizol试剂盒提取总RNA，逆转录后进行RT-PCR检测。每个样本最少重复3次，设置3个复孔。反应条件为：预变性95℃30 s；PCR反应95℃5 s，60℃30 s，共计40个循环。以2-ΔΔCt法计算RNA的相对表达量。

1.2.2 慢病毒与细胞转染慢病毒颗粒由上海伯易生物科技有限公司合成，表达特异性短发夹状RNA（shRNA）XIST或scrambled oligonucleotides。转染48 h后用嘌呤霉素（3 µg/ml）处理细胞7 d，检测绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）以评价转染效率。构建pcDNA3.1-NLRP3质粒（编码pcDNA3.1，但缺少NLRP3的3′UTR），将其转染至Lipofectamine2000。

1.2.3 细胞增殖和平板细胞克隆形成实验CCK-8试剂盒检测细胞活性，将细胞以5×103个/ml的密度接种于96孔板培养24 h、48 h、72 h和96 h后，向每孔中添加10 µl CCK-8，继续培养4 h。微孔板阅读器490 nm波长处读取吸光度。平板细胞克隆形成实验中，细胞以300个/孔接种于6孔培养板，结晶紫染色后在低倍显微镜下计算每孔细胞数大于10个克隆数，最后计算克隆成功率，评估细胞增殖能力［8］。

1.2.4 Western blot检测取对数生长期细胞加入蛋白裂解液，冰上裂解25 min，离心15 min后将上清液转移至EP管。加入SDS缓冲液并煮沸5 min使蛋白变性。经SDS-PAGE后将蛋白转移至PVDF膜，脱脂奶粉封闭1 h，孵育一抗，4℃过夜后弃去一抗，TBST洗膜3次。随后室温孵育二抗2 h，弃去二抗，TBST洗膜3次，每次5 min，最后在Bio-Rad ChemiDoc MP全能型成像系统上成像［9］。

1.2.5 荧光素酶报告分析将pmirGlO双荧光素酶miRNA靶向表达载体插入带有miR-22结合位点的XIST片段，产生pmirGLO-XIST-WT报告载体。另外构建表达miR-22突变位点的载体（pmirGLO-XISTMut）。用4 ng对照肾素荧光素酶载体、pRL-TK 200 ng萤火虫荧光素酶质粒共转染LSCC细胞，同时转染miR-22 mimics或miR-NC和pmirGLO-XIST-WT或pmirGLO-XIST-Mut［10］。48 h后用双荧光素酶报告分析系统（美国Invitrogen公司）定量荧光素酶活性。

1.2.6 动物实验24只SPF级雌性小鼠随机分为3组，每组各8只，均置于恒温恒湿的无菌室中适应性喂养3 d后，在小鼠肩胛背区皮下注射100µl PBS（内含100万个Hep-2细胞）。每周用游标卡尺测量肿瘤大小，肿瘤体积=长度×宽度2×0.5［11］。当肿瘤达到约0.5~0.6 cm3时，在3组小鼠的瘤内分别注射100 µl XIST siRNA慢病毒或100 µl GFP，每周注射1次，注射3周。治疗后1周处死小鼠，获取肿瘤组织。

1.3 统计学方法采用SPSS23.0软件进行数据分析。采用独立样本t检验或单因素测量方差分析（两两比较用LSD-t法），P<0.05说明组间比较差异有统计学意义。

2 结果

2.1 人LSCC组织中XIST和miR-22的表达RTPCR检测结果显示，与癌旁组织相比，LSCC组织中XIST表达水平较高，而miR-22表达水平较低（P<0.05）。肿瘤分期越高，XIST表达水平越高，而miR-22表达水平越低（P<0.05，图1）。

图1 癌旁组织（normal组）和LSCC组织中XIST和miR-22表达Fig.1 Expressions of XIST and miR-22 in paracancerous tissues（normal group）and LSCC tissues

2.2 XIST对Hep-2 LSCC细胞的影响用XIST特异性shRNA（shXIST1和shXIST2）和scrambled oligo‑nucleotides（对照）转染Hep-2细胞，随后用RT-PCR予以证实（图2）。CCK-8实验结果显示，下调XIST表达可抑制Hep-2细胞增殖，在细胞培养第5天时差异有统计学意义（P<0.05）。平板细胞克隆形成实验结果同样证实下调XIST的抗肿瘤增殖活性（P<0.05）。见图3。

图2 转染scrambled oligonucleotides、shXIST1和shXIST2后XIST的表达水平Fig.2 Expression level of XIST after respectively transfec⁃tion scrambled oligonucleotides，shXIST1 and shXIST2

图3 分 别 转 染scrambled oligonucleotides、shXIST1和shXIST2后对Hep-2细胞增殖的影响Fig.3 Influence for Hep-2 cell proliferation after respec⁃tively transfection scrambled oligonucleotides，shXIST1 and shXIST2

2.3 XIST对miR-22/NLRP3的靶向调节作用采用starBase平台（http：//starbase.sysu.edu.cn/）预测miR-22与XIST的结合位点（图4A）。将XIST序列中miR-22的野生型（pmirGLO-XIST-WT）和突变型（pmirGLO-XIST-Mut）结合位点克隆至报告载体，荧光素酶分析结果证实miR-22与XIST相互作用。miR-22过表达可显著抑制pmirGLO-XIST-WT活性（P<0.05），但对pmirGLO-XIST-Mut活性无影响（P>0.05，图4B）。抑制XIST后，miR-22表达水平显著上调（P<0.05，图4C）。

图4 XIST对miR-22的调控Fig.4 Regulation of miR-22 by XIST

根据targetscan（www.targetscan.org）和starBase（starbase.sysu.edu.cn）平台发现NLRP3是miR-22的潜在靶点（图5A）。构建3′UTR质粒作为载体，在构建miR-22模型后，转染野生型和突变型NLRP3到载体3′UTR质粒，并检测其荧光素酶活性。3′UTRNC为含突变型NLRP3的质粒载体，3′UTR-MU为含野生型的NLRP3的质粒载体。在荧光素酶报告试验中，miR-22过表达降低了3′UTR荧光素酶活性（P<0.05），但不影响3′UTR-NC和3′UTR-MU荧光素酶活性（P>0.05，图5B）。miRNA靶向表达载体插入带有miR-22结合位点的XIST片段后，与阴性对照及miRNA-22抑制组相比差异有统计学意义（P<0.05，图5C），提示miRNA-22 mimics构建成功。Western blot检测结果显示，下调XIST表达或miR-22过表达可导致NLRP3表达上调（P<0.05，图5D、E）。当Hep-2细胞XIST表达下调时，下调miR-22（转染miR-22 inhibitor）可恢复NLRP3的表达（与转染shXIST相比，P<0.05），而shXIST和miR-22 inhibitor共转染后NLRP3的表达水平低于单独转染miR-22 inhibitor（P<0.05，图5F）。上述结果说明XIST通过靶向miR-22调节NLRP3的表达。

图5 XIST对miR-22/NLRP3的靶向调节Fig.5 Targeted regulation of miR-22/NLRP3 by XIST

2.4 XIST通过NLRP3对肿瘤增殖活性的影响XIST的致癌活性由NLRP3介导，平板细胞克隆形成实验检测Hep-2细胞增殖活性。转染包含编码序列但缺少NLRP3 3′UTR的质粒可明显减弱下调XIST所致的抗肿瘤增殖活性（P<0.05），见图6。

图6 XIST通过NLRP3对肿瘤增殖活性的影响Fig.6 Effects of XIST on tumor proliferative activity through NLRP3

2.5 XIST对肿瘤增殖影响的体内研究shXIST慢病毒干预LSCC小鼠后，肿瘤体积和重量明显缩小，Ki-67和NLRP3表达水平降低（P<0.05），见图7。

图7 XIST siRNA抑制Hep-2肿瘤生长的体内研究Fig.7 In vivo study of XIST siRNA inhibition of Hep-2 tumor growth

3 讨论

近年来，LSCC的发病率有逐渐升高之势，且死亡率居高不下。尽管近年来治疗方法和诊断技术有了很大发展，但患者的五年生存率仍然较低，特别是晚期或有转移患者［12］，因此亟需更深入地探索LSCC的发病机制。LncRNA是近年来肿瘤研究的热点，靶向lncRNA或许能为LSCC的诊治带来曙光。

本研究发现，与癌旁组织相比，LSCC组织中XIST表达水平明显升高，且XIST表达水平与临床分期关系密切。分期越高XIST表达水平越高，说明XIST在LSCC中有重要意义。既往研究发现，XIST在肝癌、乳腺癌、肺癌和卵巢癌等中有异常表达［5，13-15］。因此可以推测，XIST对肿瘤的发生、发展有重要作用。miR-22对调控肿瘤细胞生物学行为有重要意义，有研究显示miR-22可靶向转化生长因子β受体1（TGFBR1）、BCL9L基因和NLRP3等，进而调控多种肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭［16-18］。通过调控miR-22可能是治疗癌症的有效手段。本研究显示，XIST可靶向miR-22/NLRP3通路调控LSCC的增殖。

本研究通过转染shRNA下调XIST的表达，发现下调XIST可明显抑制LSCC细胞的增殖、迁移和分化。在膀胱癌的研究中，HU等［19］的发现与本研究类似。本研究采用荧光素酶报告分析技术验证了XIST对miR-22的调控作用。既往研究表明，miR-22对肿瘤细胞有抑制作用［18］。HU等［19］发现，上调lncRNA RGMB-AS1可通过miR-22/NLRP3通路促进LSCC细胞增殖，且与LSCC患者不良预后有关。本研究发现miR-22通过结合位于NLRP3 3′UTR的miR-22种子互补位点，直接调控NLRP3表达。NLRP3是炎症小体，与癌细胞增殖、分化、侵袭和凋亡等密切相关［20-21］。本研究进一步证实XIST通过调控miR-22/NLRP3通路促进LSCC细胞增殖，下调XIST后可抑制miR-22/NLRP3通路并抑制肿瘤增殖活性。在动物实验中，用shXIST慢病毒干预LSCC小鼠后，肿瘤体积和重量明显缩小，Ki-67和NLRP3表达水平降低。说明下调XIST表达对抑制LSCC生长有积极意义。

综上所述，XIST过表达可通过调控miR-22/NLRP3通路促进LSCC增殖，靶向XIST可能为LSCC的治疗带来新的方向。本研究也存在一些局限性，例如本研究仅分析了不同分期LSCC与LSCC、miR-22的关系，未对其他病理特征进行分析，未来需要进一步探讨LSCC与临床特征及患者预后的关系。