红花多糖通过circ_0014130/miR-127-5p对皮肤鳞状细胞癌细胞的影响

丁蕾 白慧英 严玉月

（青海省第五人民医院皮肤科，西宁 810001）

皮肤鳞状细胞癌是一种皮肤恶性肿瘤，病情发展快，可发生多处转移，严重威胁着人类的生命健康；研究发现中药具有抗皮肤鳞状细胞癌的作用［1-2］。红花多糖是中药红花最重要的活性成分之一，已被证实具有抗肿瘤作用；如红花多糖可抑制胃癌MGC-803细胞、乳腺癌MDA-MB-435细胞的增殖［3-4］。红花多糖还可抑制舌鳞状细胞癌细胞的增殖，诱导细胞凋亡［5］。然而红花多糖对皮肤鳞状细胞癌细胞的增殖、迁移和凋亡的影响及机制尚不清楚。

circ_0014130（circPIP5K1A）一种环状RNA，位于chr1：151206672-151212515，研 究报道过表达hsa_circ_0014130能促进肺腺癌细胞的增殖和侵袭［6］。沉默circ_0014130可抑制非小细胞肺癌细胞的增殖和侵袭，并促进细胞凋亡［7-8］。敲除circPIP5K1A损害了结肠癌细胞活力并抑制了细胞的侵袭和迁移［9］。circNELL2通过使miR-127-5p海绵化而促进了食管鳞状细胞癌的进展［10］。circ_0026134的下调通过促进miR-127-5p表达来抑制TRIM25和IGF2BP3介导的肝癌细胞增殖和侵袭［11］。而circ_0014130和miR-127-5p对皮肤鳞状细胞癌的影响尚不清楚。本实验旨在研究红花多糖对皮肤鳞状细胞癌细胞的增殖、迁移和凋亡的影响及机制是否与circ_0014130和miR-127-5p有关。

1 材料与方法

1.1 材料SCL-1细胞株购自美国ATCC；RPMI1640培养基购自上海莼试生物技术有限公司；红花多糖购自北京伊塔生物科技有限公司；凋亡检测试剂盒和MTT试剂盒购自上海经科化学科技有限公司；蛋白提取试剂盒、吉姆萨染色液购自定州百克赛斯生物科技有限公司；Transwell小室购自美国BD公司；SYBR Premix ExTaqTM试剂盒购自日本TaKaRa公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国AAt Bioquest公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞处理与分组SCL-1细胞株用RPMI1640培养基培养，取对数生长期细胞，分别用0.16、0.32、0.64 mg/ml红花多糖处理，作为红花多糖低、中、高剂量组；不做任何处理的细胞作为对照组；将si-NC、si-circ_0014130、miR-NC、miR-127-5p转染至SCL-1细 胞，记为si-NC组、si-circ_0014130组、miR-NC组、miR-127-5p组；将pcDNA-circ_0014130、anti-miR-127-5p转染至SCL-1细胞后用0.64 mg/ml红花多糖处理，记为红花多糖+pcDNA-circ_0014130组、红花多糖+anti-miR-127-5p组。

1.2.2 流式细胞术检测细胞凋亡收集1.2.1各组细胞，按试剂盒说明操作，上流式细胞仪检测。

1.2.3 MTT检测细胞增殖活性各组细胞培养至24 h、48 h、72 h时，加入MTT溶液，孵育4 h后加入DMSO溶液，反应10 min后用酶标仪检测490 nm处吸光度（OD）值。

1.2.4 克隆形成实验检测细胞集落形成数将各组细胞接种于6孔板，出现肉眼可见克隆（约2周）时终止培养，弃去培养液，PBS浸洗2次，甲醇固定15 min，再用吉姆萨染色30 min，洗去染液，干燥后在显微镜下计数大于50个细胞的集落。

1.2.5 Transwell检测细胞迁移将细胞在无血清的培养液中培养12 h，制成浓度为5×105个/ml的细胞悬液，取100 μl加入Transwell上室，培养24 h，取出Transwell小室，用PBS洗2次，甲醇固定后用0.1%结晶紫染色，然后用显微镜观察计数细胞。

1.2.6 Western blot法检测蛋白表达提取细胞总蛋白，定量后按照30 μg/孔蛋白样品加样，进行SDSPAGE，然后转膜，再用封闭液封闭，然后加入Bax、Bcl-2、GAPDH一抗（1∶1 000）4℃孵育过夜，洗膜后加入HRP标记的二抗（1∶2 000），室温孵育2 h，洗膜后加入ECL显色，暗室下X线胶片显影、定影。分析蛋白条带灰度值，计算蛋白的相对表达量。

1.2.7 RT-qPCR检 测circ_0014130和miR-127-5p的表达水平提取各组细胞总RNA，合成cDNA后进行PCR，以GAPDH和U6为内参，相对表达量用2-ΔΔCt法计算。circ_0014130正向引物序列：5'-AGAAGTTGGAGCACTCTTGGA-3'，反向引 物 序 列：5'-AAAGTCCGAGGGTTCTGG-3'；GAPDH正向引物序列：5'-TCAAGAAGGTGGTGAAGCAGG-3'，反 向 引物序列：5'-TCAAAGGTGGAGGAGTGGGT-3'；miR-127-5p正向引物序列：5'-CTCTTCAAGCTCCAAAC⁃CAAAC-3'，反向引物序列：5'-GTATCCACCAGAAC⁃CACCAGG-3'；U6正 向引 物 序 列：5'-ATTGGAAC⁃GATACAGAGAAGATT-3'，反向引物序列：5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3'，引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2.8 双荧光素酶报告实验使用PCR扩增包含miR-127-5p结合位点的circ_0014130序列，克隆至荧光素酶表达载体中，记为WT-circ_0014130，通过定点突变构建成MUT-circ_0014130，将其分别与miR-NC和miR-127-5p共转染至SCL-1细胞，然后按照说明书检测荧光素酶活性。

1.3 统计学分析采用SPSS20.0软件进行统计学分析，符合正态分布的计量资料用±s表示，两组比较行t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 红花多糖对SCL-1增殖凋亡迁移的影响与对照组相比，红花多糖低、中、高剂量组SCL-1细胞凋亡率逐渐升高，细胞活性逐渐降低，集落形成数及迁移细胞数逐渐减少，Bax表达水平逐渐升高，Bcl-2表达水平逐渐降低，呈剂量依赖性（P<0.05，图1、表1）。

表1 红花多糖抑制SCL-1集落形成、迁移，诱导细胞凋亡（±s，n=3）Tab.1 Safflower polysaccharides inhibit SCL-1 colony formation and migration，and induce apoptosis（±s，n=3）

表1 红花多糖抑制SCL-1集落形成、迁移，诱导细胞凋亡（±s，n=3）Tab.1 Safflower polysaccharides inhibit SCL-1 colony formation and migration，and induce apoptosis（±s，n=3）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with safflower polysaccharide low dose group，2）P<0.05；compared with safflower polysac⁃charide middle dose group，3）P<0.05.

Groups Control Safflower polysaccharide low dose Safflower polysaccharide middle dose Safflower polysaccharide high dose F P Number of colonies formed 121.67±4.78 101.67±3.301）77.67±3.091）2）52.00±2.161）2）3）227.143<0.01 Apoptosis rate/%6.82±0.35 12.48±0.641）17.16±0.891）2）22.58±1.061）2）3）220.859<0.01 Number of migrating cells 177.33±7.85 142.67±5.911）110.33±4.781）2）78.00±2.941）2）3）170.491<0.01 Bax 0.21±0.02 0.42±0.031）0.67±0.031）2）0.82±0.071）2）3）122.930<0.01 Bcl-2 0.78±0.06 0.55±0.031）0.35±0.021）2）0.15±0.011）2）3）174.940<0.01

图1 红花多糖对SCL-1凋亡、细胞活性及Bax、Bcl-2蛋白表达的影响Fig.1 Effect of safflower polysaccharide on SCL-1 apop⁃tosis，cell viability and protein expressions of Bax and Bcl-2

2.2 红花多糖对SCL-1中circ_0014130和miR-127-5p表达的影响与对照组相比，红花多糖低、中、高剂量组circ_0014130表达水平逐渐降低，miR-127-5p表达水平逐渐升高，呈剂量依赖性（P<0.05，表2）。

表2 circ_0014130和miR-127-5p表达的检测（±s，n=3）Tab.2 Detection of circ_0014130 and miR-127-5p expres⁃sions（±s，n=3）

表2 circ_0014130和miR-127-5p表达的检测（±s，n=3）Tab.2 Detection of circ_0014130 and miR-127-5p expres⁃sions（±s，n=3）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with safflower polysaccharide low dose group，2）P<0.05；compared with saf⁃flower polysaccharide middle dose group，3）P<0.05.

Groups Control Safflower polysaccharide low dose Safflower polysaccharide middle dose Safflower polysaccharide high dose F P circ_0014130 1.00±0.00 0.74±0.041）0.46±0.031）2）0.23±0.021）2）3）463.276<0.01 miR-127-5p 1.00±0.00 1.76±0.061）2.34±0.071）2）3.69±0.101）2）3）837.465<0.01

2.3 干扰circ_0014130对SCL-1增殖凋亡迁移的影响与si-NC组相比，si-circ_0014130组可降低circ_0014130表达水平，提高miR-127-5p表达水平，降低细胞活性，减少集落形成数和迁移细胞数，提高细胞凋亡率及Bax表达水平，降低Bcl-2表达水平（P<0.05，图2、表3）。

表3 干扰circ_0014130抑制SCL-1集落形成、迁移，诱导细胞凋亡（±s，n=3）Tab.3 Interference with circ_0014130 inhibits SCL-1 colony formation and migration，and induces apoptosis（±s，n=3）

表3 干扰circ_0014130抑制SCL-1集落形成、迁移，诱导细胞凋亡（±s，n=3）Tab.3 Interference with circ_0014130 inhibits SCL-1 colony formation and migration，and induces apoptosis（±s，n=3）

Note：Compared with si-NC group，1）P<0.05.

Groups si-NC si-circ_0014130 t P circ_0014130 1.00±0.00 0.32±0.031）39.260<0.01 miR-127-5p 1.00±0.00 3.10±0.061）60.622<0.01 Number of colo⁃nies formed 122.33±6.02 65.67±2.051）15.432<0.01 Apoptosis rate/%6.82±0.36 20.88±0.611）34.381<0.01 Number of migrating cells 176.00±8.64 84.33±3.861）16.779<0.01 Bax 0.21±0.02 0.76±0.051）17.690<0.01 Bcl-2 0.79±0.05 0.23±0.021）18.011<0.01

图2 干扰circ_0014130对SCL-1凋亡细胞活性及Bax、Bcl-2蛋白表达的影响Fig.2 Effect of interference with circ_0014130 on activity of SCL-1 apoptotic cells and expressions of Bax and Bcl-2 proteins

2.4 过表达miR-127-5p对SCL-1增殖凋亡迁移的影响与miR-NC组相比，miR-127-5p组可降低细胞活性，减少集落形成数和迁移细胞数，提高细胞凋亡率及Bax表达水平，降低Bcl-2表达水平（P<0.05，图3、表4）。

表4 过表达miR-127-5p抑制SCL-1集落形成、迁移，诱导细胞凋亡（±s，n=3）Tab.4 Overexpression of miR-127-5p inhibits SCL-1 colony formation，migration and induces apoptosis（±s，n=3）

表4 过表达miR-127-5p抑制SCL-1集落形成、迁移，诱导细胞凋亡（±s，n=3）Tab.4 Overexpression of miR-127-5p inhibits SCL-1 colony formation，migration and induces apoptosis（±s，n=3）

Note：Compared with miR-NC group，1）P<0.05.

Groups miR-NC miR-127-5p t P 1.00±0.00 2.90±0.061）54.848<0.01 122.67±5.56 71.33±2.871）14.212<0.01 6.91±0.44 19.64±0.781）24.621<0.01 178.00±9.63 92.67±4.111）14.116<0.01 0.21±0.02 0.72±0.041）19.752<0.01 0.79±0.06 0.30±0.031）12.652<0.01 miR-127-5p Number of colonies formed Apoptosis rate/%Number of migrating cells Bax Bcl-2

图3 过表达miR-127-5p对SCL-1凋亡细胞活性及Bax、Bcl-2蛋白表达的影响Fig.3 Effect of overexpression of miR-127-5p on SCL-1 apoptotic cell activity and Bax and Bcl-2 protein expressions

2.5 circ_0014130和miR-127-5p靶向关系Circu⁃lar RNA Interactome软件 预测 显示circ_0014130和miR-127-5p有互补序列（图4A）；双荧光素酶报告实验结果显示，WT-circ_0014130与miR-127-5p共转染的细胞荧光素酶活性低于WT-circ_0014130与miR-NC共 转 染 的 细 胞；而MUT-circ_0014130与miR-127-5p共转染的细胞荧光素酶活性与miR-NC共转染的细胞比较差异无统计学意义（图4B）。

图4 circ_0014130和miR-127-5p互补序列及荧光素酶活性检测Fig.4 Complementary sequences of circ_0014130 and miR-127-5p and detection of luciferase activity

2.6 过表达circ_0014130或抑制miR-127-5p对红花多糖处理的SCL-1增殖、凋亡、迁移的影响与红花多糖组相比，红花多糖+pcDNA-circ_0014130组和红花多糖+anti-miR-127-5p组可提高细胞活性，增加集落形成数和迁移细胞数，降低细胞凋亡率，降低Bax表达水平，提高Bcl-2表达水平（P<0.05，表5、图5）。

表5 过表达circ_0014130或抑制miR-127-5p可逆转红花多糖对SCL-1集落形成迁移及凋亡的作用（±s，n=3）Tab.5 Overexpression of circ_0014130 or inhibition of miR-127-5p can reverse effect of safflower polysaccharides on SCL-1 colony formation，migration and apoptosis（±s，n=3）

表5 过表达circ_0014130或抑制miR-127-5p可逆转红花多糖对SCL-1集落形成迁移及凋亡的作用（±s，n=3）Tab.5 Overexpression of circ_0014130 or inhibition of miR-127-5p can reverse effect of safflower polysaccharides on SCL-1 colony formation，migration and apoptosis（±s，n=3）

Note：Compared with safflower polysaccharide group，1）P<0.05.

Groups Safflower polysaccharide Safflower polysaccharide+pcDNA-circ_0014130 Safflower polysaccharide+anti-miR-127-5p F P circ_0014130 0.24±0.01 0.90±0.041）-27.726<0.01 miR-127-5p 3.70±0.13 1.24±0.061）1.52±0.071）642.661<0.01 Number of colonies formed 51.33±2.49 114.33±4.641）105.33±2.051）327.225<0.01 Apoptosis rate/%22.68±1.07 8.27±0.451）10.60±0.621）310.951<0.01 Number of migrating cells 78.00±3.74 164.67±4.031）148.67±2.871）497.666<0.01 Bax 0.82±0.07 0.24±0.021）0.30±0.021）160.632<0.01 Bcl-2 0.14±0.01 0.72±0.041）0.63±0.051）208.786<0.01

图5 过表达circ_0014130或抑制miR-127-5p可逆转红花多糖对SCL-1凋亡、细胞活性及Bax、Bcl-2蛋白表达的作用Fig.5 Overexpression of circ_0014130 or inhibition of miR-127-5p can reverse effect of safflower polysac⁃charide on SCL-1 apoptotic，cell activity and Bax，Bcl-2 protein expressions

3 讨论

研究表明多数中药多糖具有增强机体免疫力及抗肿瘤等药理作用［12］。因此，开发新的中药多糖对防治皮肤鳞状细胞癌具有重要意义。研究报道红花多糖能显著抑制HT29结肠癌细胞，诱导HT29细胞凋亡［13］。红花多糖通过抑制PI3K/Akt途径抑制细胞增殖，诱导宫颈癌细胞凋亡［14］。红花多糖通过阻断PI3K/Akt途径抑制小细胞肺癌细胞系A549和YTMLC-90细胞的增殖并诱导凋亡，并抑制体内肿瘤的生长［15］。NK细胞与红花多糖对体外杀伤结肠癌细胞具有协同作用［16］。以上结果表明红花多糖对多种肿瘤具有抗癌作用。本实验结果显示，红花多糖低、中、高剂量处理后的SCL-1细胞凋亡率升高，细胞活性降低，集落形成数及迁移细胞数减少，Bax表达水平升高，Bcl-2表达水平降低，且呈剂量依赖性；表明红花多糖呈剂量依赖性抑制SCL-1细胞增殖和迁移，并诱导细胞凋亡。

研究报道CircPIP5K1A通过miR-376c-3p/ZNF146轴促进胃癌的进展［17］。circPIP5K1A通过miR-600/HIF-1α调节促进非小细胞肺癌的增殖和转移［18］。本实验结果显示，抑制circ_0014130表达后SCL-1细胞的活性降低，细胞凋亡率升高，Bax表达水平升高，Bcl-2表达水平降低，集落形成数和迁移细胞数减少；表明抑制circ_0014130表达可抑制SCL-1细胞增殖和迁移，诱导细胞凋亡。为进一步研究circ_0014130影响皮肤鳞状细胞癌的机制，本实验通过在线软件预测circ_0014130可能靶向结合的miRNA，结果显示，circ_0014130与miR-127-5p有结合位点，且双荧光素酶报告实验证明circ_0014130靶向调控miR-127-5p。研究发现过表达miR-127-5p可抑制结直肠癌细胞增殖［19］。miR-127-5p可抑制肝细胞癌细胞的生长［20］。本实验结果显示，过表达miR-127-5p后，细胞活性降低，细胞凋亡率升高，集落形成数和迁移细胞数减少；表明过表达miR-127-5p可抑制SCL-1细胞增殖和迁移，诱导细胞凋亡。miR-127-5p在皮肤鳞状细胞癌中同样起抑癌基因作用。

此外，本实验还发现红花多糖处理后的SCL-1细胞中circ_0014130表达水平降低，miR-127-5p表达水平升高；而过表达circ_0014130或抑制miR-127-5p可逆转红花多糖对SCL-1细胞增殖、迁移及凋亡的作用。提示，红花多糖对SCL-1细胞增殖、迁移及凋亡的影响可能与circ_0014130和miR-127-5p有关。

综上所述，红花多糖可能通过调控circ_0014130/miR-127-5p抑制皮肤鳞状细胞癌SCL-1细胞的增殖、迁移，并诱导细胞凋亡。