四妙勇安汤含药血清对ox-LDL诱导的泡沫化巨噬细胞活化与自噬的影响①

于红红 陈茜 李芳 罗瑞熙 王腊 赵立凤 俞琦 许滔 田维毅

（贵州中医药大学，贵阳 550025）

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是一种慢性炎症性疾病，也是导致心脑血管疾病发生的重要因素，AS形成及发展与炎症反应、血管内皮细胞功能障碍、脂代谢功能紊乱等多种因素密切相关［1］。巨噬细胞通过吸收氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）并沉积于动脉壁导致泡沫化巨噬细胞聚集，形成AS斑块［2］。已有大量研究证明，中医药治疗AS疗效确切，近年关于清热解毒法治疗AS的研究也日益增多。四妙勇安汤为古代治疗热毒炽盛之脱疽的著名方剂，出自《验方新编》，由金银花、玄参、当归、甘草四味药组成。现代研究证实其具有抗炎、降脂、稳定斑块、抗血栓形成等药理作用，临床多用于治疗血栓闭塞性脉管炎、AS、高血压、冠心病等疾病，但其抗AS的分子机制尚不明确［3-5］。本研究以ox-LDL诱导的泡沫化巨噬细胞为AS体外模型，探究四妙勇安汤含药血清对泡沫细胞活化及自噬的作用，为AS“热毒蕴结”学说提供新的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物与细胞SPF级雄性SD大鼠，体质量（200±10）g，购自长沙天勤公司，生产许可证号：SCXK（湘）2014-0011；小鼠RAW264.7巨噬细胞购自上海中桥新舟公司。

1.1.2 药物与主要试剂四妙勇安汤按原方比例配伍（金银花90 g、玄参90 g、当归60 g、甘草30 g），购自北京同仁堂贵阳店，常规制备水煎液；DMEM培养基、胎牛血清（Hyclone）；细胞消化液（eBioscience）；青链霉素双抗（南京维森特）；ox-LDL（广州奕源生物YB-002）；CCK-8试剂盒（日本同仁LF673）；油红O细胞染色、BCA测定试剂盒（G1262、C0020，北京索莱宝）；IL-6、IL-10、IFN-γ ELISA试剂盒（EK206/3、EK210/4、EK280/3，联科）；LC3B、p-mTOR、p-p70S6K抗体（CST3868、5536、9234）、GAPDH抗体（Affinity T0004）、p-AMPK抗体（8813R，北京博奥森）；雷帕霉素（V900930，Sigma）。

1.2 方法

1.2.1 含药血清制备40只SD大鼠适应性喂养5 d，随机分为正常对照组、四妙勇安汤低、中、高剂量组，每组10只，按“动物与人体等效剂量换算系数”计算大鼠给药剂量，低、中、高剂量分别为15.75、31.5、63 g/（kg·d）［6］。正常对照组灌胃给予等量生理盐水，2次/d，连续1周。股动脉取血，离心，收集上清，灭活补体，过滤除菌后分装保存。

1.2.2 细胞培养和干预RAW264.7细胞培养于含10%胎牛血清、10 μl/ml青链霉素双抗的DMEM高糖培养基（37℃、5%CO2）。实验中细胞分为正常对照组、低、中、高剂量含药血清组、模型组、雷帕霉素组。除正常对照组外，其余组均加入终浓度为66 μg/ml的ox-LDL共培养24 d建立泡沫细胞模型。正常对照组及模型组采用20%正常对照组血清干预24 h；低、中、高剂量组分别给予20%浓度的低、中、高剂量含药血清干预24 h；雷帕霉素组采用mTOR抑制剂雷帕霉素（1 μmol/L）干预24 h。

1.2.3 油红O染色观察细胞脂滴弃上清，PBS洗3次，油红O固定液固定25 min，油红O染色液浸染15 min，苏木素染色液复染核1~2 min，水洗后镜下观察。

1.2.4 CCK-8检测泡沫细胞活性用含10%胎牛血清、青链霉素双抗10 μl/ml的DMEM高糖培养液调整细胞浓度至5×104个/ml，100 μl/孔接种于无菌96孔板，干预细胞后弃培养基，将正常对照组、含药血清高剂量组分别按10%、20%、30%、40%和50%浓度加入孔中，全部加样均设6个复孔，孵育24 h后按说明书操作加入试剂，酶标仪检测450 nm处吸光度。

1.2.5 ELISA检测IL-6、IL-10和IFN-γ表达取正常对照组、模型组、不同剂量含药血清组培养24 h后的细胞培养基上清，按ELISA试剂盒说明书采用酶标仪检测IL-6、IL-10和IFN-γ表达。

1.2.6 透射电镜观察细胞自噬水平变化按1.2.2干预细胞，电镜固定液4℃固定4 h，PBS洗3次，锇酸固定液固定2 h，脱水，包埋，切片，染色，透射显微镜采集图像。

1.2.7 免疫荧光标记法检测LC3Ⅱ表达取对数生长期RAW264.7细胞，调整细胞浓度至5×104个/ml，1 ml/孔接种于含有无菌盖玻片的24孔板，按1.2.2方法干预细胞。4%多聚甲醛固定，PBS洗3次，甩干，加入破膜液孵育，洗涤，封闭，弃培养液，加入一抗孵育过夜，洗涤，加入二抗孵育，洗涤，加入DAPI染液避光室温孵育，洗涤，抗荧光淬灭封片剂封片，荧光显微镜下观察并采集图像。

1.2.8 RT-PCR检测AMPK、mTOR、p70S6K mRNA表达收集各组细胞，Trizol法抽提总RNA，逆转录为cDNA，PCR仪扩增。AMPK正向引物序列：5'-AACCTGAGAACGTCCTGCTTGATG-3'，反 向：5'-TGACTTCTGGTGCGGCATAATTGG-3'；mTOR正 向引物：5'-CTGATCCTCAACGAGCTAGTTC-3'，反向：5'-GGTCTTTGCAGTACTTGTCATG-3'；p70S6K正 向引物：5'-CTGATTTATGCCTTTCAGACCG-3'，反向：5'-CCTTTTTGATGTAAATGCCCCA-3'；内参GAPDH正向引物：5'-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3'，反向：5'-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3'。PCR扩增条件为：95℃30 s，1个循环；95℃5 s，55℃10 s，38个循环。2-ΔΔCt法计算基因相对表达。

1.2.9 Western blot检 测p-AMPK、p-mTOR和p-p70S6K蛋白表达收集细胞，高效细胞裂解液提取细胞蛋白，BCA试剂盒测定蛋白浓度，调整各组蛋白浓度，沸水浴煮10~15 min使蛋白变性，SDSPAGE电泳，转至PVDF膜，封闭，依次孵育一抗、二抗，洗膜，加入显影剂，ChemiDocXRS化学发光成像系统显色、曝光，Image Lab软件分析条带灰度值。

1.3 统计学分析采用SPSS23.0软件进行统计学分析。计量资料以±s表示，组间比较采用t检验，其余采用单因素方差分析。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 油红O染色鉴定泡沫细胞正常对照组巨噬细胞未见明显橘红色脂滴；ox-LDL诱导的泡沫化巨噬细胞明显可见胞内橘红色脂滴增多，说明细胞内存在大量脂质，证实泡沫化巨噬细胞模型建立成功（图1）。

图1 油红O染色观察RAW264.7细胞及泡沫细胞（×200）Fig.1 Oil red O staining of RAW264.7 cells and foam cells（×200）

2.2 四妙勇安汤含药血清对泡沫化巨噬细胞活性的影响CCK-8结果显示（表1），与正常对照组相比，含药血清高剂量组在10%~30%浓度范围内细胞活力差异无统计学意义（P>0.05），随浓度增加，细胞活力呈逐渐下降趋势（P<0.05）。后续将采用不影响细胞活力剂量范围内的20%浓度含药血清进行实验。

表1 四妙勇安汤含药血清对泡沫化巨噬细胞活性的影响（±s，n=6）Tab.1 Effect of Si-Miao-Yong-An-Decotion containing serum on foam macrophage activity（±s，n=6）

表1 四妙勇安汤含药血清对泡沫化巨噬细胞活性的影响（±s，n=6）Tab.1 Effect of Si-Miao-Yong-An-Decotion containing serum on foam macrophage activity（±s，n=6）

Note：Compared with Control，1）P<0.05.

Groups Control High dose Percentage of concentration 10%1.134±0.056 1.027±0.104 20%1.154±0.067 1.045±0.078 30%1.148±0.102 1.021±0.084 40%1.118±0.076 0.841±0.0751）50%1.041±0.064 0.751±0.0591）

2.3 四妙勇安汤含药血清对泡沫细胞IL-6、IL-10和IFN-γ的影响与正常对照组相比，ox-LDL刺激巨噬细胞24 h后，IL-6、IFN-γ水平显著升高，IL-10水平显著降低（P<0.05）；与模型组相比，含药血清各剂量组作用于泡沫化巨噬细胞24 h后，IL-10分泌增加，IL-6、IFN-γ分泌明显减少（P<0.05，表2）。

表2 各组细胞上清IL-6、IL-10和IFN-γ含量比较（±s，n=6，pg/ml）Tab.2 Comparison of contents of IL-6，IL-10 and IFN-γ in cell supernatant of each group（±s，n=6，pg/ml）

表2 各组细胞上清IL-6、IL-10和IFN-γ含量比较（±s，n=6，pg/ml）Tab.2 Comparison of contents of IL-6，IL-10 and IFN-γ in cell supernatant of each group（±s，n=6，pg/ml）

Note：Compared with Control，1）P<0.05；compared with Model，2）P<0.05.

Groups Control Model Low dose Middle dose High dose IL-6 2 346.37±109.58 3 053.46±86.171）2 643.61±71.432）2 216.49±80.572）2 104.73±101.462）IL-10 140.75±10.26 105.43±11.051）123.97±17.042）151.63±15.062）149.47±14.122）IFN-γ 1 568.36±81.24 2 476.84±102.531）2 017.56±96.542）1 426.82±75.362）1 354.74±63.492）

2.4 透射电镜观察细胞自噬水平变化电镜结果显示，正常对照组与模型组未见自噬小体；而四妙勇安汤含药血清各剂量组与雷帕霉素组均可见双层膜包裹的内含细胞器的自噬小体，同时部分泡沫细胞线粒体结构受损，嵴消失（图2）。

图2 透射电镜观察细胞超微结构（×1 500）Fig.2 Transmission electron microscope detection of cell ultrastructure（×1 500）

2.5 细胞免疫荧光标记检测自噬蛋白LC3Ⅱ细胞自噬诱导过程中自噬体形成的特点为LC3Ⅱ转化率提高，荧光染色下可见斑点状聚集于自噬体内膜附近。荧光二抗Cy3-山羊抗兔荧光素标记LC3发出的红光为阳性表达，蓝色为DAPI染色的细胞核。荧光结果显示，正常对照组和模型组细胞几乎不可见LC3Ⅱ点状聚集；经含药血清各剂量组及雷帕霉素组处理的细胞LC3Ⅱ呈阳性红光点分布，雷帕霉素组阳性点数量最为显著（图3）。

图3 荧光显微镜检测细胞LC3Ⅱ表达（×200）Fig.3 Fluorescence microscope detection LC3Ⅱexpres⁃sion（×200）

2.6 四妙勇安汤含药血清对AMPK、mTOR、p70S6K mRNA的影响与正常对照组相比，模型组AMPK mRNA表达降低，mTOR和p70S6K mRNA表达提升（P<0.05）。与模型组相比，含药血清组及雷帕霉素组干预后AMPK mRNA表达显著升高，而mTOR和p70S6K mRNA表达显著降低（P<0.05，表3）。

表3 各组细胞AMPK、mTOR、p70S6K mRNA表达（±s，n=3）Tab.3 AMPK，mTOR，p70S6K mRNA expressions in each group of cells（±s，n=3）

表3 各组细胞AMPK、mTOR、p70S6K mRNA表达（±s，n=3）Tab.3 AMPK，mTOR，p70S6K mRNA expressions in each group of cells（±s，n=3）

Note：Compared with Control，1）P<0.05；compared with Model，2）P<0.05.

Groups AMPK mTOR p70S6K Control Model Low dose Middle dose High dose Rapamycin 1.00±0.00 0.74±0.091）1.19±0.082）1.24±0.102）1.28±0.072）1.34±0.122）1.00±0.00 1.16±0.071）0.74±0.102）0.78±0.072）0.65±0.082）0.60±0.092）1.00±0.00 1.25±0.111）0.84±0.072）0.69±0.062）0.71±0.082）0.64±0.072）

2.7 四妙勇安汤含药血清对p-AMPK、p-mTOR、p-p70S6K蛋白表达的影响与正常对照组相比，模型组p-AMPK蛋白表达降低，p-mTOR和p-p70S6K蛋白表达升高（P<0.05）。与模型组相比，含药血清组及雷帕霉素组干预后p-AMPK蛋白表达显著升高，而p-mTOR和p-p70S6K蛋白表达显著降低（P<0.05，图4、表4）。

图4 各组p-AMPK、p-mTOR、p-p70S6K蛋白表达Fig.4 p-AMPK，p-mTOR and p-p70S6K protein expres⁃sions in each group

表4 各组细胞p-AMPK、p-mTOR、p-p70S6K蛋白表达（±s，n=3）Tab.4 p-AMPK，p-mTOR and p-p70S6K protein expres⁃sions in each group of cells（±s，n=3）

表4 各组细胞p-AMPK、p-mTOR、p-p70S6K蛋白表达（±s，n=3）Tab.4 p-AMPK，p-mTOR and p-p70S6K protein expres⁃sions in each group of cells（±s，n=3）

Note：Compared with Control，1）P<0.05；compared with Model，2）P<0.05.

Groups Control Model Low dose Middle dose High dose Rapamycin p-AMPK 1.00±0.00 0.76±0.051）1.52±0.162）1.62±0.182）1.86±0.152）1.91±0.202）p-mTOR 1.00±0.00 1.13±0.051）0.92±0.102）0.86±0.082）0.84±0.072）0.77±0.042）p-p70S6K 1.00±0.00 1.12±0.151）0.91±0.052）0.90±0.082）0.76±0.042）0.61±0.072）

3 讨论

AS是多种心脑血管疾病形成的基础病理因素，其发病机制涉及内皮细胞损伤、脂代谢失常、平滑肌细胞增殖和分化、巨噬细胞浸润等多个环节［7-8］。自噬对维持细胞内稳态起关键作用，是一种细胞稳态的溶酶体依赖性的降解过程，参与机体多种慢性炎症性疾病、心脑血管系统疾病、肿瘤等多种疾病过程［9］。自噬在AS发生发展乃至斑块破裂等不同阶段均发挥作用，影响AS进程，为AS防治研究提供了新靶点［10］。微管相关蛋白1轻链3（LC3）常用于自噬相关蛋白检测，脂化后的LC3为LC3Ⅱ，常用于评估自噬活性［11］。AMPK/mTOR/p70S6K是自噬经典通路之一，在自噬调控中起关键作用。AMPK、mTOR、p70S6K是AKT/mTOR/p70S6K通 路 关键 分子，mTOR可通过抑制自噬途径诱导巨噬细胞泡沫细胞形成，从而促进AS病理过程，p70S6K是负性自噬调节通路mTOR的关键下游激酶，AMPK激活可抑制mTOR、p70S6K磷酸化，诱导自噬，延缓AS进程［12］。IL-6、IL-10、IFN-γ等炎症因子激活可介导自噬，而适度自噬又可抑制炎症因子表达［13］。

本研究采用不同浓度四妙勇安汤含药血清干预RAW264.7源性泡沫细胞，通过CCK-8法观察含药血清对泡沫细胞活化的影响，确定含药血清干预浓度为20%。目前，体外建立巨噬细胞泡沫化模型最常用的为ox-LDL。研究表明，ox-LDL可诱导内皮细胞自噬且呈剂量依赖性［14］；但也有研究报道，ox-LDL可抑制THP-1源性巨噬细胞自噬，且呈时间和剂量依赖性［15-16］。ox-LDL诱导细胞泡沫化过程中，可抑制亦可诱导细胞自噬，可能与ox-LDL浓度、诱导时间、是否联合其他诱导药物使用以及细胞种类密切相关。本研究采用66 μg/ml ox-LDL诱导RAW264.7细胞，油红O染色结果显示，经ox-LDL诱导的细胞内明显可见大量橘红色脂滴，说明ox-LDL可诱导巨噬细胞泡沫化。与模型组相比，含药血清抑制促炎因子IL-6和IFN-γ表达，诱导抑炎因子IL-10表达；与模型组相比，含药血清组和雷帕霉素组自噬小体数量增加，LC3Ⅱ阳性点数量增多以及调控AMPK/mTOR/p70S6K信号通路，诱导细胞自噬。

综上所述，四妙勇安汤含药血清可调节ox-LDL诱导的泡沫化巨噬细胞活化，降低细胞炎症因子表达，诱导细胞自噬，可能是其防治AS的作用机制之一。