蒺藜淫羊藿复合物对大鼠性功能及精子活力的影响

梁志健严家荣陈桂煌张建军陈润红邝少松*

(1.广东省医学实验动物中心,广东佛山 528248；2.广东省人民医院广东省医学科学院,广州 510080)

据统计40～70 岁男性中有约52%患有不同程度的性功能障碍,主要表现为性欲减退、阴茎勃起障碍、射精障碍及精子活力下降等[1-2]。 其原因可能与雄激素水平降低、机体疲劳、处于亚健康、疾病等有关。 寻找能改善性功能障碍的安全有效的药物及保健食品具有深远的意义。 中医认为“肾藏精、主生殖”,“肾者作强之官,伎巧出焉”,因此,中医补肾法是治疗性功能障碍和精子异常的基本治法[3-5]。 蒺藜淫羊藿复合物便是根据这一治法,由淫羊藿、蒺藜、西洋参提取物组方而成。 本课题在半去势雄性大鼠模型基础上,通过观察蒺藜淫羊藿复合物对模型大鼠的交配行为、睾酮含量、精子活力等指标的影响,综合评价其是否具有增强性功能,改善性功能障碍的作用。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF 级 SD 大鼠,100 只,雌雄各半,8 周龄,271～298 g；购自广东省医学实验动物中心[SCXK(粤)2018-0002], 合 格 证 号 为: 44007200039469、44007200039470。 实验于广东省医学实验动物中心进行[SYXK (粤) 2018-0002],实验证明号为:00169157、00169158。 饲养条件:5 只/笼,自由进食饮水,采用12 h ∶12 h 昼夜间断照明,饲养室条件始终保持稳定。 本研究经广东省医学实验动物中心实验动物伦理委员会审核(B201704-8),符合3R原则。

1.2 主要试剂与仪器

十一酸睾酮软胶囊(药品级,浙江医药股份有限公司新昌制药厂)；戊巴比妥钠(分析纯,德国默克公司)；苯甲酸雌二醇注射液(药品级,宁波第二激素厂)；黄体酮注射液(药品级,赤峰博恩药业有限公司)；睾酮检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

BL-420 S 型生物机能仪(成都泰盟软件有限公司)；CX21 型生物显微镜(日本奥林巴斯)。

1.3 实验方法

1.3.1 剂量设计与样品配制

蒺藜淫羊藿复合物由汤臣倍健股份有限公司提供,由蒺藜、淫羊藿、西洋参和辅料组成,其中每100 g 含总皂苷不低于2.0 g、淫羊藿苷不低于0.5 g。 根据《保健食品检验与评价技术规范》(2003 年版),蒺藜淫羊藿复合物以成人推荐用量的10 倍、30 倍设为大鼠的低、高剂量,即分别为0.51、1.52 g/kg。 配制方法:称取8.36 g 蒺藜淫羊藿复合物粉末,用纯净水溶解至55 mL,得质量浓度0.152 g/mL的蒺藜淫羊藿复合物高剂量溶液。 取14 mL 的高剂量溶液,用纯净水稀释至42 mL,得0.051 g/mL 的低剂量溶液。

阳性对照品选用十一酸睾酮,以成人推荐用量的10 倍设为大鼠的剂量,即0.02 g/kg。

1.3.2 动物分组及处理

雄鼠的处理:50 只大鼠随机分为正常对照组10只和造模组40 只。 造模组动物按45 mg/kg 腹腔注射戊巴比妥钠麻醉,摘除右侧睾丸、左侧不做处理。正常对照组大鼠做假手术处理。 术后各组动物肌肉注射青霉素钠,每只80000 U,每天1 次,连续3 d。 术后3 d,造模组动物按体重随机分为模型对照组、阳性对照组、蒺藜淫羊藿复合物低、高剂量组,每组10 只。 阳性对照组动物灌胃给予十一酸睾酮,蒺藜淫羊藿复合物低、高剂量组灌胃给予相应浓度的蒺藜淫羊藿复合物溶液,其余组别给予纯净水,灌胃体积均为10 mL/kg,1 次1 d,共40 d。

雌鼠的处理:50 只大鼠按45 mg/kg 腹腔注射戊巴比妥钠麻醉,摘除双侧卵巢。 术后按上述方法肌注青霉素钠进行抗感染处理。

1.3.3 交配实验

为使去势的雌鼠同时发情,进行交配实验前2 d,皮下注射给予苯甲酸雌二醇,剂量为0.2 mg/kg；交配实验前4 h,皮下注射给予黄体酮,剂量为2 mg/kg。 雄鼠在灌胃第30 天晚上按1 只/笼放入饲养笼中,适应环境5 min 后,然后每笼投入1 只发情雌鼠。 记录投入雌鼠起40 min 内,雄鼠首次捕捉雌鼠的时间、首次射精的时间、捕捉及射精的次数,并计算每组雄鼠的捕捉率和射精率[6]。

1.3.4 阴茎勃起实验

雄鼠在结束第35 天灌胃的1 h 后,检测动物的阴茎勃起潜伏期。 将生物机能仪的电极固定于阴茎根部,以35 V、35 Hz 的电流进行刺激,记录刺激开始到阴茎充血勃起的时间,记为阴茎勃起潜伏期[6]。

1.3.5 睾酮、脏器系数检测

雄性大鼠第40 天末次灌胃1 h 后,动物腹腔注射戊巴比妥钠麻醉,腹主动脉采血,离心,取上清,根据试剂盒说明书检测其中睾酮的含量。 大鼠采血、安乐死后,取睾丸、包皮腺、提肛肌、肾上腺、精囊腺+前列腺,称重后按公式计算脏器系数。

1.3.6 精子数量、活动率与活力检测

取左侧附睾,用剪刀中间剪开,放入1 mL 生理盐水中,振揺并放置10 min,使精子充分溢出,取1滴该液体置于血细胞计数板中,在显微镜下计数,得到每毫升稀释液中含有的精子数量。 再取1 滴该液体置于血细胞计数板中,显微镜下观察200 个精子,记录活动精子数目,按下列公式计算精子活动率[7]。

在观察活动率的同时,观察精子活力,精子活动分为 a、b、c、d 四个级别,a 级:精子呈快速直线前向运动；b 级:慢速或呆滞的前向运动；c 级:非前向运动；d 级:死精子。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 蒺藜淫羊藿复合物对半去势大鼠交配实验的影响

如表1 所示,模型对照组雄性大鼠的捕捉率较正常对照组降低(P＜0.01)。 与模型对照组比较,阳性对照组捕捉率升高(P＜0.01),精力能低、高剂量组的捕捉率、射精率和射精次数升高,具有显著差异(P＜0.05)。

表1 蒺藜淫羊藿复合物对半去势大鼠交配实验的影响(, n=10)Table 1 Effects of Tribulus terrestris and Epimedium complex on mating test of hemi-castrated rats

表1 蒺藜淫羊藿复合物对半去势大鼠交配实验的影响(, n=10)Table 1 Effects of Tribulus terrestris and Epimedium complex on mating test of hemi-castrated rats

注:与正常对照组相比,**P＜0.01；与模型对照组相比,＃P＜0.05,＃＃P＜0.01。Note. Compared with the normal control group,**P＜0.01. Compared with the model control group,＃P＜0.05,＃＃P＜0.01.

组别Groups捕捉率(%)Capture rate射精率(%)Ejaculation rate捕捉次数(次)Capture times射精次数(次)Ejaculation times正常对照组Normal control group 80 60 9.2±6.3 11.3±10.0模型对照组Model control group 60** 50 11.8±14.1 10.2±5.4阳性对照组Positive control group 100＃＃ 60 21.3±13.1 25.0±11.5＃蒺藜淫羊藿复合物低剂量组Low dose group 100＃＃ 80＃＃ 30.4±19.9 26.8±15.8＃蒺藜淫羊藿复合物高剂量组High dose group 100＃＃ 70＃＃ 30.9±26.4 28.0±18.8＃

2.2 蒺藜淫羊藿复合物对去势雄性大鼠性功能、激素及生殖系统的影响

如表2 及表3 所示,蒺藜淫羊藿复合物低剂量组能显著提高去势雄性大鼠血清中睾酮的含量(P＜0.05),同时显著增加精囊腺和前列腺系数(P＜0.05)。 而高剂量组可见缩短阴茎勃起潜伏期的趋势,但无显著性(P＞0.05)。

表2 蒺藜淫羊藿复合物对去势大鼠勃起潜伏期、血清睾酮的影响(,n=10)Table 2 Effects of Tribulus terrestris and Epimedium complex on erectile times and serum-testosterone level of hemi-castrated rats

表2 蒺藜淫羊藿复合物对去势大鼠勃起潜伏期、血清睾酮的影响(,n=10)Table 2 Effects of Tribulus terrestris and Epimedium complex on erectile times and serum-testosterone level of hemi-castrated rats

注:与正常对照组相比,**P＜0.01；与模型对照组相比,＃P＜0.05,＃＃P＜0.01。Note. Compared with the normal control group,**P＜0.01. Compared with the model control group,＃P＜0.05,＃＃P＜0.01.

组别Groups勃起潜伏期(s)Erectile times睾酮(nmol/L)Testosterone正常对照组Normal control group 5.01±4.01 24.1±3.7模型对照组Model control group 9.27±3.01 17.6±3.8**阳性对照组Positive control group 8.72±3.65 24.6±5.0＃＃蒺藜淫羊藿复合物低剂量组Low dose group 9.48±4.48 21.2±3.3＃蒺藜淫羊藿复合物高剂量组High dose group 7.05±3.09 20.7±3.3

表3 蒺藜淫羊藿复合物对去势大鼠性器官脏器系数的影响(, n=10)Table 3 Effects of Tribulus terrestris and Epimedium complex on genital organs coefficient of hemi-castrated rats

表3 蒺藜淫羊藿复合物对去势大鼠性器官脏器系数的影响(, n=10)Table 3 Effects of Tribulus terrestris and Epimedium complex on genital organs coefficient of hemi-castrated rats

注:与正常对照组相比,*P＜0.05；与模型对照组相比,＃P＜0.05。Note. Compared with the normal control group,*P＜0.05. Compared with the model control group,＃P＜0.05.

组别Groups脏器系数(mg/g)Organ coefficient睾丸Testicles包皮腺Preputial glands精囊腺和前列腺Seminal vesicles and prostate glands正常对照组Normal control group 3.68±0.16 0.33±0.10 5.97±0.45模型对照组Model control group 3.59±0.30 0.31±0.08 5.29±0.74*阳性对照组Positive control group 3.76±0.64 0.32±0.11 5.98±0.89＃蒺藜淫羊藿复合物低剂量组Low dose group 3.86±0.19 0.35±0.12 6.03±0.64＃蒺藜淫羊藿复合物高剂量组High dose group 3.69±0.57 0.35±0.13 5.84±0.85

2.3 蒺藜淫羊藿复合物对去势雄性大鼠精子数量、精子活动率及精子活力的影响

如表4 所示,与正常对照组比较,模型对照组的精子数量减少(P＜0.01)、精子活动率降低(P＜0.01)、呈快速直线前向运动的精子减少(P＜0.01)、非前向运动的精子和死精子增多(P＜0.01)。 与模型对照组比较,蒺藜淫羊藿复合物高剂量组的精子活动率升高(P＜0.01),呈快速直线前向运动的精子增多(P＜0.05),死精子数量减少(P＜0.01)。

表4 蒺藜淫羊藿复合物对去势大鼠精子数量、精子活动率和活力的影响(, n=10)Table 4 Effects of Tribulus terrestris and Epimedium complex on sperm counts, activity ratio and vitality on hemi-castrated rats

表4 蒺藜淫羊藿复合物对去势大鼠精子数量、精子活动率和活力的影响(, n=10)Table 4 Effects of Tribulus terrestris and Epimedium complex on sperm counts, activity ratio and vitality on hemi-castrated rats

注:与正常对照组相比,**P＜0.01；与模型对照组相比,＃P＜0.05,＃＃P＜0.01。Note. Compared with the normal control group,**P＜0.01. Compared with the model control group,＃P＜0.05,＃＃P＜0.01.

组别Groups精子数量(×108/mL)Sperm count精子活动率(%)Motility rate精子活动强度(%)Motility rate a 级Level a b 级Level b c 级Level c d 级Level d正常对照组Normal control group 1.05±0.04 73.5±2.4 125±10 14±6 9±3 53±5模型对照组Model control group 0.78±0.12** 66.4±3.0** 105±7** 15±4 13±3** 67±6**阳性对照组Positive control group 0.94±0.05＃ 70.9±3.6 116±8 13±2 13±3 58±7蒺藜淫羊藿复合物低剂量组Low dose group 0.92±0.02 68.7±2.7 114±5 11±1 13±2 63±5蒺藜淫羊藿复合物高剂量组High dose group 0.91±0.02 70.1±2.1＃＃ 116±5＃ 12±3 12±2 60±4＃＃

3 讨论

随着环境的污染、饮食习惯的改变及生活压力的增加,男性的生殖功能障碍呈明显的上升趋势,主要表现性欲地下、勃起功能障碍、射精障碍、精子数量及活力降低等[8-10]。 其中多见于中老年人群,这可能与该类人群受到各种压力的影响,机体处于疲劳的状态有关。 此外,睾酮作为雄激素的主要成份,与男性性功能、生育功能有着密切关系,可促进性器官的发育、第二性征的维持、精子发生及成熟,而伴随着年龄增长的睾酮分泌水平下降。 机体的疲劳状态和睾酮分泌减少,共同影响着中老年男性的性功能健康。

中医作为我国传统文化的瑰宝,具有十分重大的研究意义,根据中医理论指导开发方药及保健食品一直是研究热点,本课题便是从传统中医理论出发,寻找可以改善上述人群性功能的保健食品。 中医认为肾藏精,主生殖,为先天之本。 肾精不足,命门火衰则会出现性欲减退、阴茎勃起困难等表现,这与男性长期受到各种压力而导致的疲劳状态和伴随年龄增长的雄激素分泌减少所导致的性功能障碍极为相似,所以补肾益精及补气类中药常用于开发为改善性功能障碍的产品[11-13]。

淫羊藿是小檗科淫羊藿属多年生草本植物,有坚筋骨、益精气、补腰膝、强心力等作用。 现代药理研究表明,淫羊藿的主要成分是黄酮类和多糖,淫羊藿总黄酮及其标志成分淫羊藿苷可减缓睾丸组织的退行性变化,具有雄激素样作用,对下丘脑-垂体-性腺轴系统起正向调节作用,促进睾酮分泌[14-15]；此外,淫羊藿可以减轻大鼠受高强度运动量的影响,维持在正常生理水平,同时促进蛋白质合成,抑制氨基酸和蛋白质分解,提高运动训练大鼠血红蛋白含量和糖原的储备,从而增强大鼠抗疲劳能力[16-17]。 西洋参具有补气益血、清肺肾、凉心脾、清虚火、生津止渴、补阴退热、调补五脏、安神除烦、固精等功效。 现代研究证明,西洋参主要有效成分为人参皂苷类成分,西洋参在抗疲劳、增强免疫力等方面均有良好的功效[18-19]。 蒺藜为蒺藜科植物蒺藜的果实,具有平肝解郁、活血祛风、明目止痒的功效。 蒺藜主要含有皂苷类、黄酮类、生物碱类、多糖类等化合物,其中的蒺藜总皂甙能促进精液产生,增加性欲,促进雌性大鼠发情,提高生殖能力；临床研究发现可增加男人的精子数及活力,治疗男性性功能低下,其作用可能与其提高体内性激素的含量有关[20-23]。 这一功效可能与其中的原薯蓣皂甙在体内通过代谢转化成脱氢表雄酮有关。同时蒺藜可以促进蛋白质合成,抑制氨基酸和蛋白质分解,提高血红蛋白含量和糖原的储备,增强抗疲劳能力。 蒺藜淫羊藿复合物便是由淫羊藿提取物、西洋参提取物和蒺藜提取物组方而成,在增强机体抗疲劳能力的基础上加以补肾益精的作用。

选择合适的指标和合适的动物模型,是客观评价样品功效的关键。 大鼠交配过程中的捕捉次数、射精次数、捕捉率和射精率可直接反映其性功能的强弱,作为评价性功能常用的指标。 而附性器官,如包皮腺、精囊腺和前列腺等,在受到雄激素的影响时,会被促进发育而重量增加,所以附性器官的重量变化可反应样品的雄激素样作用。 单侧去势雄鼠能模拟人体睾酮分泌减少的状态,雄性大鼠经单侧去势后,交配过程中捕捉率降低,阴茎勃起潜伏期延长,精囊腺和前列腺系数降低,精子数量、精子活动率降低,死精子增加。 故本课题采用了这一动物模型对蒺藜淫羊藿复合物的改善性功能功效进行评价。

本课题研究发现,由淫羊藿、西洋参和蒺藜提取物组方而成的蒺藜淫羊藿复合物可提高半去势雄性大鼠交配过程中的捕捉率、射精率和射精次数,促进精囊腺和前列腺的生长发育,同时改善睾酮缺乏所致的精子数量减少、精子活力低下,这些功能可能与蒺藜淫羊藿复合物增加睾酮分泌和雄激素样作用有关。 因此,蒺藜淫羊藿复合物可适用于体力疲劳和年龄增长所致的雄激素分泌低下的人群,改善其性功能表现。