羊肚菌液体培养基及多糖提取工艺的优化

许俊齐，谢春芹*，曹婷，凡军民，宋金俤

江苏农林职业技术学院茶与食品科技学院（句容 212400）

羊肚菌（Morchella）又名美味羊肚菌，俗称羊雀菌、包谷菌等，按Ainsworth分类系统隶属于子囊菌亚门、盘菌纲、盘菌目、羊肚菌科、羊肚菌属[1-2]。据《本草纲目》记载，羊肚菌具有化痰理气、补脑提神、润胃健脾、补肾强身之功效[3]。

羊肚菌富含多糖、氨基酸、甾醇、有机酸等活性物质。文献检索表明，羊肚菌多糖具有调节免疫能力、抗肿瘤、抗氧化、抗HIV、降血压等生物活性[4-6]。羊肚菌多糖主要来源于固态发酵中的子实体和孢子以及液体发酵中的菌丝体和胞外发酵液，其产量的高低与试验菌株、培养基和培养条件等因素密切相关。

羊肚菌作为中国的四大名菌之首，其应用价值受到各方关注。对于羊肚菌方面的研究仅限于栽培技术、羊肚菌子实体提取多糖和营养成分功效研究等方面，而利用液体发酵技术生产羊肚菌菌丝体并提取多糖方面的研究，鲜有报道。液体深层发酵具有稳定性高、操作简便、生产周期短、不受季节和气候等外界因素限制等优点，是取代固体栽培种植的必然趋势[7]。通过液体发酵羊肚菌菌丝体，营养价值及有效成分指标不亚于子实体，因而具有广阔的开发和应用前景。试验通过对羊肚菌菌种进行液体深层发酵培养，探讨相应碳源、氮源及培养温度与装液量对其菌丝干质量与总多糖含量的影响。通过单因素试验及正交试验研究探讨提取温度、料液比、浸提时间等，为羊肚菌菌丝液体培养基多糖提取的深层次开发提供借鉴意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

羊肚菌种及羊肚菌（江苏食用菌研究所）；黄豆粉、玉米粉、马铃薯等（市售食品级）；葡萄糖、蛋白胨、硫酸镁、磷酸二氢钾（国药集团化学试剂有限公司）。

恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂）；FA 2104 N分析天平（上海精密科学仪器有限公司）；超净工作台（苏州净化设备有限公司）；DHG-9123 A电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；L 520微波炉（合肥荣事达三洋电器股份有限公司）；CH 2176电磁炉（杭州九阳生活电器有限公司）；HS-6恒温水浴锅（金坛市杰瑞尔电器有限公司）；电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；FD-2C真空冷冻干燥机（北京博医康仪器有限公司）。

1.2 培养基

1.2.1 平板培养基

马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，水1 000 mL。

1.2.2 一级摇瓶培养基

葡萄糖0.2%，蛋白胨0.2%，磷酸氢二钾0.1%，硫酸镁0.05%，磷酸二氢钾0.05%，VB110片，水1 000 mL。

1.2.3 二级摇瓶培养基

葡萄糖0.2%，蛋白胨0.2%，磷酸二氢钾0.05%，硫酸镁0.1%，VB110片，水1 000 mL。

1.2.4 三级摇瓶培养基（液体培养基）

参考聂建军等[9]的培养基配方组成：葡萄糖0.2%，玉米粉0.2%，黄豆粉0.25%，蛋白胨0.25%，磷酸二氢钾0.1%，硫酸镁0.05%，水1 000 mL。

1.3 试验方法

1.3.1 羊肚菌菌丝培养步骤

1.3.1.1 菌种活化

参考江洁等[10]的方法，将保存的羊肚菌菌种用接种针接种到平板培养基上，在20～25 ℃的生化培养箱中培养7 d左右，菌丝可长满试管。

1.3.1.2 一级摇瓶培养

将经过活化的羊肚菌菌种接种到一级摇瓶培养基中（500 mL的三角瓶装液150 mL），一级摇瓶培养条件为接入经过斜面培养的羊肚菌菌种2 cm2，在28 ℃条件下振荡培养5～6 d。

1.3.1.3 二级摇瓶培养

将一级摇瓶培养的羊肚菌菌种接种到二级摇瓶培养基中进行二级摇瓶培养，在28～30 ℃条件下培养8 d，所得羊肚菌菌种为生产摇瓶二级种。

1.3.1.4 发酵培养

将二级种与发酵培养基的体积比为10%的接种量接种于发酵培养基中，发酵培养5 d，进行扩大培养，得到一级发酵羊肚菌菌种。

1.3.1.5 发酵罐培养

一级发酵羊肚菌菌种接入装有发酵培养基的发酵罐中进行发酵罐培养24～36 h后，过滤，得羊肚菌菌丝[11]。

1.3.1.6 羊肚菌菌丝多糖提取工艺流程

参考任嘉兴等[4]的方法，称取定量真空干燥后的羊肚菌菌丝体置于锥形瓶，恒温水浴，按4 500 r/min离心15 min，上清液浓缩，加入4倍体积无水乙醇，4 ℃冰箱中醇沉12 h，离心，沉淀干燥得粗多糖。

1.3.2 液体培养基成分单因素试验

在前期试验基础上，判定液体培养基中碳源葡萄糖及玉米粉添加量、氮源中蛋白胨及黄豆粉的添加量，矿质元素中KH2PO4及MgSO4对羊肚菌液体菌丝生长情况存在显著影响，故设定：葡萄糖及玉米粉添加量为0.10%+0.10%，0.15%+0.15%，0.20%+0.20%，0.25%+0.25%，0.30%+0.30%和0.35%+0.35%；微量元素中KH2PO4及MgSO4添加量为0.15%+0.10%，0.20%+0.15%，0.25%+0.2%，0.30%+0.25%，0.35%+0.30%和0.40%+0.35%；蛋白胨及黄豆粉添加量为0.15%+0.15%，0.20%+0.20%，0.25%+0.25%，0.30%+0.30%，0.35%+0.35%和0.40%+0.40%；并以菌丝体干质量为评价指标，试验重复3次，取平均值，确定三者最优添加量。

1.3.3 羊肚菌液体培养基优化正交试验

从单因素中筛选出不同水平的葡萄糖及玉米粉添加量、矿质元素中KH2PO4及MgSO4、氮源中蛋白胨及黄豆粉的添加量，并设置空列，进行L9(34)正交试验，因素及水平设定见表1。每个处理3次重复，进行振荡培养，测定其菌丝体鲜质量及总多糖含量。

表1 培养基正交L9(34)试验因素与水平 单位：%

1.3.4 羊肚菌菌丝多糖提取工艺优化正交试验

在参考文献[12-13]及前期单因素基础上，选择提取温度、料液比、浸提时间作为试验因素，并设置一空白列，并以羊肚菌菌丝多糖提取得率作为评价指标，进行L9(34)正交试验。正交试验因素及水平设定见表2。

表2 多糖提取正交L9(34)试验因素与水平

1.4 试验指标测定方法

1.4.1 羊肚菌菌丝体干质量测定方法

羊肚菌菌丝体发酵液，采用0.150 mm孔径（100目）筛网过滤，用称过质量后的干燥滤纸抽滤，将菌丝体用蒸馏水抽滤3次，烘干至恒质量后称其质量，即得羊肚菌菌丝体干重[14]。

1.4.2 总多糖测定

参照苯酚-硫酸法[15]。

1.4.3 多糖得率[16]

2 结果与分析

2.1 葡萄糖及玉米粉添加量对羊肚菌菌丝体干重的影响

羊肚菌菌丝生长可利用多种碳源，其中复合碳源相比单一碳源更具有价格优势。葡萄糖属于单糖，菌丝生长前期，有利于菌丝快速萌发生长，降低污染率，玉米粉属多糖，伴随菌丝分解代谢同时，逐步提供所需碳源，保证菌丝后期生长[17]。

葡萄糖及玉米粉添加量对羊肚菌菌丝体干重的影响具体见图1。随着葡萄糖及玉米粉添加量增加，羊肚菌菌丝体干重呈现逐步升高趋势。葡萄糖及玉米粉添加量均为0.3%，菌丝干重量达到最高值1.21 g/L。继续添加此2种碳源则干质量有所下降，分析原因在于较高浓度的培养基，导致溶氧量减少，影响羊肚菌菌丝的正常生长。

图1 葡萄糖及玉米粉添加量对羊肚菌菌丝体干重的影响

2.2 KH2PO4及MgSO4添加量对羊肚菌菌丝体干重的影响

KH2PO4及MgSO4添加量对羊肚菌菌丝干重的影响见图2。两者为羊肚菌菌丝生长提供必需的矿质元素，是不可或缺的一类物质。随着KH2PO4及MgSO4的适量添加，羊肚菌菌丝干重呈现平稳增加，而后又逐渐下降。添加量为0.3%和0.25%时，菌丝干重达到最高值1.16 g/L，继续添加量增加，菌丝干重却无明显增加，而后出现下降，分析原因在于，较高浓度的矿质元素，影响菌丝的正常生长。据此分析认为，KH2PO4及MgSO4最佳添加量为0.3%及0.25%。

图2 KH2PO4及MgSO4添加量对羊肚菌菌丝干重的影响

2.3 蛋白胨及黄豆粉添加量对羊肚菌菌丝体干重的影响

氮源作为羊肚菌菌丝合成氨基酸、蛋白质、核酸等的前体物质，在液体培养基中具有非常重要的作用。蛋白胨富含有机氮化合物，亦含有一些维生素和糖类，常被作为微生物培养基的主要原料。此外，黄豆粉属于混合氮源，价格低廉，营养丰富，可减少液体培养基制作成本[18]。蛋白胨及黄豆粉添加量对羊肚菌菌丝体干重的影响见图3。结果表明：蛋白胨及黄豆风添加量对羊肚菌菌丝重影响较为明显，蛋白胨及黄豆粉添加量均为0.35%时，每升培养液中的菌丝干质量达1.42 g；继续添加量增加，羊肚菌菌丝干质量增加不明显，分析原因可能在于，过量营养对于菌丝增长并无明显作用，据此蛋白胨及黄豆粉添加量均为0.35%是最适液体培养基氮源添加量。

图3 蛋白胨及黄豆粉添加量对羊肚菌菌丝干重的影响

2.4 羊肚菌液体培养基工艺优化

2.4.1 正交试验结果的极差分析

液体培养基L9(34)试验结果分析见表3。由表3液体培养基优化正交试验表中的R值可知，影响羊肚菌菌丝干质量为C＞A＞B＞D，即蛋白胨及黄豆粉添加量＞葡萄糖及玉米粉添加量＞KH2PO4及MgSO4添加量。根据液体培养基配方优化的结果分析得出，优化后的配方为A3B2C2，即葡萄糖及玉米粉添加量均为0.35%、KH2PO4添加量0.30%及MgSO4添加量为0.25%、蛋白胨及黄豆粉添加量均为0.35%。羊肚菌菌丝在此配方条件下生长状况良好，羊肚菌菌丝干质量保持在较高水平。

表3 液体培养基L9(34)试验结果分析

对试验结果进行方差分析，即在试验条件下，葡萄糖及玉米粉添加量、蛋白胨及黄豆粉添加量对羊肚菌菌丝干质量影响显著（p＜0.05），微量元素KH2PO4及MgSO4添加量对羊肚菌菌丝干质量影响不显著。

2.4.2 扩大性验证试验

获得的优化方案A3B2C2在9组试验之外，为进一步验证确认其在实际生产中的可靠性与可行性，故以其为条件，即葡萄糖及玉米粉添加量均为0.35%、KH2PO4添加量0.30%及MgSO4添加量为0.25%、蛋白胨及黄豆粉添加量均为0.35%，进行扩大性（中试）验证试验，试验重复3次，测定其菌丝干质量平均值为1.57±0.02 g/L，试验结果优于9组试验组，表明该配方为较佳的羊肚菌液体培养基组成条件。

2.5 羊肚菌菌丝体多糖提取工艺优化

2.5.1 正交试验结果的极差分析

由表4羊肚菌菌丝多糖提取正交试验表中的R值可知，羊肚菌菌丝多糖提取率的影响因素A＞C＞B＞D，即提取温度＞料液比＞提取时间。根据羊肚菌菌丝多糖提取工艺优化的结果分析得出，优化后的工艺为A2B1C3，即控制提取温度70 ℃、提取时间70 min、料液比控制1∶35（mg/mL）。在此条件下，羊肚菌菌丝多糖提取率保持在最高水平。

表4 多糖提取L9(34)试验结果分析

接表4

此外，对试验结果进行方差分析，即在该试验条件下，提取温度、提取时间及料液比皆对羊肚菌菌丝多糖提取影响显著（0.01＜p＜0.05）。

2.5.2 扩大性验证试验

获得的优化方案A2B1C3未在9组试验之列，为验证确认其在实际生产中的可靠性与可行性，故以其为条件，即提取温度70 ℃、提取时间70 min、料液比1∶35（mg/mL），进行扩大性（中试）验证试验，试验重复3次，测定其菌丝多糖提取率为4.02%±0.12%，试验结果优于9组试验组，表明该工艺为较佳的羊肚菌菌丝多糖提取工艺。

3 结论

对羊肚菌液体培养基碳源、氮源及微量元素进行优化，结果表明，葡萄糖及玉米粉添加量均为0.35%、KH2PO4添加量为0.30%及MgSO4添加量为0.25%、蛋白胨及黄豆粉添加量均为0.35%，羊肚菌菌丝体菌丝干质量平均值为1.57±0.02 g/L，保持在较高水平；王云龙[19]通过研究认为，羊肚菌液体发酵的最佳培养基条件为麦芽汁9.5%、玉米粉40 mg/L、黄豆粉20 mg/L、酵母粉30 mg/L，与试验采用相似混合碳源及氮源，对于降低液体培养基制作成本、满足羊肚菌菌丝后期生长需要具有重要作用。

在对羊肚菌菌丝多糖提取工艺研究过程中，通过正交试验分析得出，最优组合为提取温度70 ℃，提取时间70 min、料液比控制1∶35（mg/mL）。以多糖得率为评价指标，该工艺条件可明显提高羊肚菌菌丝多糖的提取率达4.02%±0.12%。任嘉兴等[4]研究认为在对于羊肚菌子实体多糖进行提取时，液料比41∶1 mL/g、提取温度88 ℃、提取时间3 h，在此条件下重复3次，羊肚菌多糖得率稳定在4.24%±0.17%。与试验的区别在于原料不同，选用干燥后的羊肚菌菌丝体，能缩短提取时间，多糖提取效率基本相近。周益帆等[5]采用碱液提取羊肚菌多糖，控制温度90 ℃、提取时间5 h、添加碱液浓度0.7 mol/L、料液比1∶20 g/mL条件下得到的羊肚菌多糖得率为5.39%，但提取时间长。此外，后期可对得到的羊肚菌菌丝多糖的安全性及抗氧化性等方面进行进一步研究。