河南省部分地区鸡源沙门菌分离鉴定与耐药性分析

2022-02-18巩新廷苏玉贤

中国动物传染病学报 2022年6期

巩新廷，石岩，苏玉贤

（1.内黄县畜牧兽医服务中心，安阳 456300；2.焦作市动物卫生监督所，焦作 454000；3.平顶山市畜牧技术推广站，平顶山 467000）

沙门菌（Salmonella）是肠杆菌科的重要致病菌属，在人和动物的肠道细胞内寄生，有2500多种血清型[1]，绝大部分血清型对人类和畜禽有致病性，引起动物腹泻、人急性胃肠炎和食物中毒。鸡源沙门菌病通常造成雏鸡腹泻、脱水，甚至死亡，成年鸡呈慢性或隐性感染，长期携带病原菌，蛋鸡产蛋性能下降。病鸡和带菌鸡为主要传染源，可以水平和垂直传播，种鸡场一旦发生疫情很难净化，严重危害养鸡业健康发展，同时也直接威胁公共卫生安全。目前，使用抗生素依然是养鸡场防治该病主要手段。但是，长期滥用抗生素导致沙门菌株耐药性增强，尤其是多重耐药现象不断出现，动物成为耐药菌的重要储存库[2]，给有效防治沙门菌病带来很大困难。

本研究采集2021年河南省平顶山等地区鸡源病料进行细菌分离鉴定、血清型分析和耐药性检测，为今后鸡源沙门菌病净化、筛选临床安全合理用药提供指导依据。

1 材料与方法

1.1 病料来源和菌株无菌采集河南部分地区35个规模鸡场疑似鸡沙门菌病鸡肝脏、心脏和肠道等样品154份作为待检病料。肠炎沙门菌标准株（CVCC3377）和大肠埃希氏菌（ATCC29922）购自中国兽医药品监察所。

1.2 主要培养基和试剂缓冲蛋白胨水增菌液（BPW）、麦康凯培养基和LB液体培养基、四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液、法国科马嘉沙门菌属显色培养基购自青岛海博生物技术有限公司；细菌微量生化反应管、沙门菌属诊断血清（60种）、DL2000 DNA marker、2×PCR Premix购自宁波天润生物药业有限公司；15种K-B药敏纸片包括大观霉素（SPT）、氨苄西林（AMP）、环丙沙星（CIP）、呋喃唑酮（FUR）、阿米卡星（AN）、氟苯尼考（FLO）、链霉素（STR）、复方新诺明（SXT）、新霉素（NTL）、阿奇霉素（AZM）、多西环素（DOX）、左氧氟沙星（LEV）、庆大霉素（CN）、头孢曲松（CTRX）、头孢喹肟（CTX）均购自杭州天河微生物试剂有限公司。

1.3 细菌分离培养无菌采集病死鸡的肝脏、脾脏、肺脏、肛拭子和用生理盐水清洗鸡蛋表面的污水等病料接种于BPW，36℃±1℃、220 rpm培养12 h后，取1 mL增菌液转入10 mL TTB，42℃±1℃培养18 h，再用接种环取适量TTB增菌液划线接种于法国科马嘉沙门菌显色培养基，36℃±1℃培养21 h，挑取疑似沙门菌单个菌落染色镜检，观察菌体形态，并在麦康凯培养基上进行纯化培养。

1.4 生化试验将分离纯化的细菌接种于细菌微量生化反应管中，再放入恒温箱中，37℃培养24～48 h，观察记录结果，结果依据《GB4789.4—2016 食品微生物学检验沙门菌检验》[3]进行判定。

1.5 PCR鉴定采用水煮法提取细菌DNA制备模板。挑取待检纯化后的菌落接种于LB液体培养基，37℃振荡培养12 h，10 000×g离心3～5 min，弃掉上清液。灭菌ddH2O洗3次，再用ddH2O重悬，煮沸10 min，冰浴冷却5 min，10 000×g离心3～5 min，取上清液为DNA模板，-20℃保存，备用。根据GenBank（登录号：JQ665438.1）发表的序列，针对沙门菌fimY基因设计一对引物，上游引物序列5'-CGCCCAGCCATACGGATAACC-3'，下游引物序列5'-TACCACGCAGGAAAGACACC-3'。由中美泰和生物技术（北京）有限公司合成，预期扩增片段大小427 bp。PCR反应体系（25 μL）：2×PCR Premix 12.5 μL，DNA模板0.5 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O补至25 μL。反应条件：95℃预变性5 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30个循环；最后72℃延伸10 min。取5 μL扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，使用凝胶成像仪观察结果并记录。大肠埃希氏菌ATCC29922为阴性对照和肠炎沙门菌标准株CVCC3377为阳性对照。

1.6 血清型鉴定分离菌株的血清型分群和定型鉴定采用GB 4789.4-2016标准中的玻片凝集试验方法。待检菌以1.2%LB琼脂作为测定A～F、O、H抗原的培养基，37℃培养12 h，用生理盐水制备成2麦氏单位的菌悬液。从血清型鉴定试剂盒中取20 μL的血清于洁净玻片上，再挑取20 μL菌悬液与血清摇动混匀30 s，观察凝集结果。同时，设生理盐水为阴性对照试验，观察菌株是否发生自凝现象。1 min内凝集者判为阳性，均匀浑浊或清亮者为阴性。根据菌体O抗原和鞭毛H抗原鉴定结果，查阅沙门菌抗原式进行被检菌株血清型分群和定型。

1.7 药敏试验药敏质控菌株为肠炎沙门菌标准株CVCC3377。采用WHO提供的药敏纸片琼脂扩散法（Kirby-Baue）测定48株分离菌对15种常见抗菌药的耐药性，测量抑菌圈直径大小，依据美国临床和实验室标准协会标准（Clinical & Laboratory Standards Institute, CLSI）判定15种抗生素敏感（S）、中介（I）和耐药（R）结果，根据药敏试验判定耐药表型。

2 结果与讨论

2.1 细菌分离培养革兰氏染色为阴性，镜检可见短杆状菌，两端钝圆，单个、成对或成丛存在。疑似菌在法国科玛嘉沙门菌属显色培养基呈现为大小一致、边缘整齐的紫色小菌落，在麦康凯培养基上可见无色、半透明、光滑菌落，符合沙门菌生长特性。共有48株初步判定为疑似沙门菌菌株。

2.2 生化试验结果生化试验鉴定结果表明，48株分离菌株均能分解甘露醇、葡萄糖和山梨醇，不发酵蔗糖，赖氨酸、硫化氢和动力吲哚鸟氨酸试验阳性，靛基质、尿素、V-P试验阴性，依据食品安全国家标准沙门菌检验标准（GB 4789.4—2016），有48株符合沙门菌生化鉴定特征。

2.3 PCR鉴定结果部分分离菌株检测结果见图1。凝胶电泳结果显示，以沙门菌fimY基因引物对48株分离菌株PCR扩增鉴定，均能扩增出大小为427 bp的目的片段，与预期片段大小一致，对照菌株扩增结果为阴性。结合生化鉴定结果，本次从154份病料样品中共鉴定分离出48株鸡沙门菌，总分离率为31.17%。对来自河南省不同地区鸡源沙门菌鉴定结果统计，48株沙门菌中安阳13株（27.08%），新乡9株（18.75%），郑州7株（14.58%），平顶山11株（22.92%），焦作8株（16.67%），表明上述地区均有不同程度鸡源沙门菌感染。钱明珠等[4]对河南省部分鸡沙门菌流行病调查，分离率为27.97%；廖成水等[5]报道，河南部分地区鸡源沙门菌分离率为15.89%。本研究高于上述检测率，表明近年来鸡源沙门菌感染有上升的趋势，需要加强鸡沙门菌病的净化控制。

图1 部分分离菌株的PCR鉴定结果Fig.1 The PCR identification results of isolated strains

2.4 血清型鉴定结果采用玻片凝集法对48株沙门菌血清型分型试验，鉴定结果显示，共鉴定出44株沙门菌的血清型，占沙门菌分离株的91.67%（44/48），其余4株未确定出血清型。鉴定出的44株沙门菌分属3个大群5种血清型，包括19株鸡白痢沙门菌（43.18%）、13株肠炎沙门菌（29.54%）、7株鼠伤寒沙门菌（27.27%）、3株甲型副伤寒沙门菌（6.18%）和2株乙型副伤寒沙门菌（4.45%）。优势血清型为鸡白痢沙门菌、肠炎沙门菌和鼠伤寒沙门菌。河南省部分地区鸡源沙门菌血清型分布见表1。

表1 河南省部分地区鸡源沙门菌血清型分布Table 1 Distribution of serotypes of Salmonella from chicken in some areas of Henan Province

2.5 药敏试验结果对48株鸡源沙门菌进行15种抗生素耐药性检测，结果见表2。对氨苄西林耐药率最高，为95.83%，其次对呋喃唑酮、大观霉素、链霉素也具有较高的耐药性，介于62.50%～66.67%；对环丙沙星、氟苯尼考、复方新诺明和左氧氟沙星耐药菌株占比介于10.42%～22.92%；对阿米卡星、新霉素、阿奇霉素、多西环素、庆大霉素、头孢曲松、头孢喹肟的耐药率最低，介于2.08%～8.33%。48株鸡源沙门菌抗生素耐药谱结果见表3。2株（4.17%）对所有试验药物敏感，37株至少对3种或3种以上的抗生素出现耐药性，多重耐药率占77.08%（37/48）；以4重和5重耐药最多，有25株，占52.08%（25/48），最多为8重耐药，有1株，占2.08%（1/48）。耐药模式较多，耐药表型主要为AMP+FUR+SPT+STR。沈学怀等[6]报道，安徽地区禽源沙门菌对左氧氟沙星、阿米卡星和阿奇霉素等高度敏感；戴建华等[7]从江苏苏中地区分离的22株沙门菌对阿米卡星、甲氧胺嘧啶、萘啶酮酸、庆大霉素、诺氟沙星的耐药率均为72.73%～100%，表现严重的耐药性，与本研究结果基本一致。