当归芍药散对PM2.5致雄性生殖损伤大鼠睾丸组织代谢组学的影响

何慧慧,刘卫红，贾 瑞,王 晶,林珊珊,马宁怡,刘新光,李 亚1，

1)河南中医药大学呼吸疾病中医药防治省部共建协同创新中心 郑州 450099 2)河南中医药大学第一附属医院中心实验室中药药理(呼吸)实验室 郑州 450099

男性生育能力下降，已成为不可忽视的公共健康问题。影响男性生殖功能的因素较多，空气污染、电离辐射、慢性炎症、不良生活习惯等均有生殖毒性，可引起生殖器官及精子结构损伤或功能障碍，最终导致不育。颗粒物(particulate matter,PM)2.5是指空气动力学当量直径<2.5 μm的PM，作为影响大气质量的主要污染物，可随呼吸运动进入人体，不仅导致呼吸系统损伤，还可随血液循环，对远处脏器造成损害。当归芍药散出自《金匮要略》“妇人妊娠病脉证并治第二十”，作为妇科疾病的常用方剂之一，为历代医家所推崇。近年来，在中医异病同治的理论指导下，其应用范围逐渐扩大，不仅对于急慢性盆腔炎、妊娠病、月经病等妇科病具有良好疗效[1]，还对睾丸鞘膜积液、精索静脉曲张、附睾炎等男科疾病也具有较好治疗效果[2]。本研究探讨了当归芍药散对PM2.5暴露大鼠肺组织、睾丸组织及睾丸组织代谢物的影响,为防治PM2.5暴露导致的雄性生殖损伤的基础研究及临床治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 动物分组及主要试剂、仪器SPF级雄性SD大鼠18只，6～8周龄，体重200～220 g，由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供[SCXK(鲁)2014007]；适应性喂养1周后，采用随机数字表法分成对照组、PM2.5组、当归芍药散组，每组6只。当归芍药散颗粒剂(相当于含生药量：当归9 g、白芍48 g、川芎24 g、茯苓12 g、白术12 g、泽泻24 g)由四川新绿色药业科技发展股份有限公司提供，灌胃时采用蒸馏水配制为0.11 kg/L的溶液。PM2.5实时在线浓缩富集系统、动物全身动态暴露系统(北京慧荣和科技有限公司)。LEICA-DM6000B型显微镜及显微照相系统(莱卡，德国)，超快速液相色谱、四极杆轨道离子阱质谱、真空离心浓缩仪、XCalibur质谱数据采集软件(赛默飞,美国)，反向色谱柱、亲水作用色谱柱(沃特世,英国)。

1.2 干预措施采用PM2.5实时在线浓缩富集系统对大气中PM2.5进行分离、浓缩后输入密封的动物全身动态暴露系统，采用PM2.5实时在线浓缩富集系统和DUST TRAKTM Ⅱ系统同步实时记录暴露箱内的PM2.5浓度、温度、湿度。每天PM2.5组及当归芍药散组大鼠暴露4 h，暴露浓度为573.61 μg/m3，持续12周。对照组无暴露期间动物饲养于独立通风笼具的过滤空气环境中。自PM2.5暴露第9周起对照组和PM2.5组给予生理盐水(2 mL/只)灌胃，当归芍药散组给予2 g/(kg·d)当归芍药散，1次/d灌胃。每周称取大鼠体重以调整灌胃剂量，持续给药4周。

1.3 肺组织病理学观察给药结束后处死大鼠，左肺经气管-支气管插管，体积分数10%中性甲醛固定72 h，以肺门为中心，连续切取3 mm厚的组织块，石蜡包埋，4 μm厚切片，HE染色，光镜下观察肺组织形态结构。

1.4 睾丸组织病理学观察取左侧睾丸，在改良的Davidson′s固定液中固定18～24 h，于体积分数10%甲醛溶液中继续固定24 h。将睾丸从中部横切，取4 mm厚的组织块，石蜡包埋，4 μm厚切片，HE染色，光镜下观察组织形态结构。

1.5 睾丸组织代谢组学分析

1.5.1样本处理 ①反相色谱分析样本处理方法：称取50 mg睾丸组织，研磨后加入300 μL甲醇和1 mL甲基叔丁基醚混匀振荡1 h，3 000 r/min、4 ℃离心10 min，取上层溶液300 μL挥干，100 μL甲醇复溶后置于200 μL内衬管中，待测。②亲水色谱分析样本处理方法：称取50 mg睾丸组织，研磨后加1 mL乙腈∶水体积比1∶1的溶液混匀振荡30 min，3 000 r/min、4 ℃离心10 min，取上层溶液100 μL，置于200 μL内衬管中，待测。

1.5.2气相色谱-质谱联用仪条件 ①色谱条件。反相色谱分离条件：色谱柱，1.8 μm,2.1 mm×100 mm；流动相，A(乙腈∶水体积比4∶6，体积分数0.1%甲酸，10 mmol/L乙酸铵)和B(乙腈∶异丙醇体积比9∶1，体积分数0.1%甲酸，10 mmol/L乙酸铵)；按设置程序进行梯度洗脱，流速0.3 mL/min，进样量为1 μL，柱温50 ℃。亲水色谱分离条件：色谱柱，1.7 μm,2.1 mm×100 mm；流动相，A(乙腈，体积分数0.1%甲酸，10 mmol/L乙酸铵)和B(水，体积分数0.1%甲酸，10 mmol/L乙酸铵)；按设置程序进行梯度洗脱，流速0.3 mL/min，进样量为1 μL，柱温40 ℃。②质谱条件：正离子离子源电压为3.7 kV，毛细管加热温度320 ℃，翘气压206.7 kPa，辅助气压68.9 kPa，容积加热蒸发温度300 ℃，翘气和辅助气均为氮气。碰撞气为氮气，气压为0.2 Pa，一级全扫描参数为分辨率70 000，自动增益控制目标为1×106，最大隔离时间50 ms，质荷比扫描范围50～1 500，液质系统由XCalibur 2.2 SP 1.48软件控制，数据采集和靶向代谢物定量处理均由该软件操作。

1.5.3代谢组学数据处理 将数据导入Progenesis QI软件，进行峰对齐、峰提取、归一化等处理，代谢物鉴定采用人类代谢组数据库和脂质数据库进行一级相对分子质量匹配，删除变异系数超过15%的代谢特征。将整合好的数据导入SIMCA中进行统计分析，通过无监督模式的主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)建立代谢组学数据模型，模型适配程度通过参数R2X和Q2来评估，R2X>0.50和Q2>0.50表明适配性和预测性较好；同时，以VIP>1为重要差异代谢物标准。所筛选得到的差异代谢物输入Metabo Analyst(http：//www.metaboanalyst.ca/)网站中进行通路分析，Impact值>0.1为潜在相关差异代谢通路。

1.6 统计学处理所有数据采用SPSS 21.0进行处理。各组大鼠代谢产物的比较采用单因素方差分析和LSD-t检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 3组大鼠肺组织病理学观察对照组大鼠肺泡壁结构完整，未见明显形态损伤；PM2.5组大鼠肺泡周围少量炎症细胞浸润，肺泡腔渗出增多，肺泡壁断裂、增厚；当归芍药散组上述病理损伤有效改善(图1)。

A：对照组；B：PM2.5组；C：当归芍药散组

2.2 3组大鼠睾丸组织病理学观察对照组大鼠睾丸组织生精细胞排列整齐、致密，形态基本正常；PM2.5组生精细胞排列稀疏、紊乱，层次由正常6～7层减少至3～4层，且胞浆出现空泡，生精小管内精子细胞及精子减少；当归芍药散组上述病理改变减轻(图2)。

A：对照组；B：PM2.5组；C：当归芍药散组

2.3 3组大鼠睾丸组织代谢组学分析

2.3.1质控分析 反相色谱正离子和亲水色谱正离子模式下的总离子流图轮廓总体相似，标准品均能相对聚集在中心点附近。见图3。

2.3.2代谢组学数据分析 OPLS-DA分析显示，反相色谱正离子和亲水色谱正离子模式下，PM2.5组大鼠睾丸组织代谢轮廓较对照组发生明显改变，当归芍药散组代谢轮廓较PM2.5组发生明显改变，介于对照组与PM2.5组之间(图4)。

A：总离子流图；B：PCA得分图；a：反相色谱正离子，b：亲水色谱正离子

2.3.3差异代谢物的筛选及通路富集 PM2.5组与对照组比较，共筛选出神经酰胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺等25个重要差异代谢产物(表1)，富集于苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成和苯丙氨酸代谢等11条代谢通路(表2)；PM2.5组与当归芍药散组比较，共筛选出左旋谷氨酰胺、左旋胱氨酸、肌酸等21个差异代谢产物(表3)，富集于丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸、α-亚麻酸代谢等5条代谢通路(表4)。

表1 对照组、PM2.5组重要差异代谢物

续表1

表2 对照组、PM2.5组潜在相关差异代谢通路

表3 PM2.5组、当归芍药散组重要差异代谢物

表4 PM2.5组、当归芍药散组差异代谢通路

与对照组相比，PM2.5组大鼠睾丸组织代谢物磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱等含量降低，当归芍药散组上述产物含量明显上调(表5、6)。将上述差异代谢物进行通路分析，共富集于5条代谢通路(表7)，主要为甘油磷脂代谢通路。

表5 3组大鼠磷脂酰乙醇胺类代谢物含量的比较

表6 3组大鼠磷脂酰胆碱类代谢物含量的比较

表7 3组差异代谢通路比较

3 讨论

目前全球有5千万～8千万人患有不孕不育症，其中男性因素占所有不育病例的20%～70%[3]。最常见的因素是精子质量及活性降低，而日益加重的空气污染导致的生殖损伤是精子损伤的重要原因之一。本研究结果表明，PM2.5暴露12周不仅可引起大鼠肺泡壁断裂、炎症细胞浸润等病理变化，还可造成大鼠睾丸组织细胞排列紊乱，生精小管内精子及生精细胞减少，而中药当归芍药散对此具有较好的改善作用。

中医认为雾霾为外来之邪，虚实夹杂为其致病机制，虚为内在基础，实指毒燥湿三气。毒邪日久耗气伤正，可致病症迁延，多变，顽固难愈，导致脏腑功能失调，进而影响包括生殖功能在内的全身功能，治疗应辨清邪正关系，以祛邪扶正为主[4-5]。当归芍药散以肝脾失调、营虚血瘀、脾虚水湿为病机[6]，方中重用白芍为君，具敛肝、合营、止痛之效，佐以当归、川芎以调肝、养血活血，配以茯苓、白术、泽泻健脾渗湿利水，全方共奏养血活血利水、调和肝脾、祛瘀毒平阴阳之功。

睾丸是天然缺氧的器官，生殖细胞在其各个发育阶段需利用不同的代谢途径来产生能量[7-8]。糖、脂质、蛋白质三大物质代谢作为机体能量来源，在其中发挥重要作用。丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸及谷氨酰胺是睾丸支持细胞的重要能量底物，在生精能量供应中发挥作用，保证精母细胞和精子的生成与成熟[9]。天冬氨酸可通过与睾丸间质细胞及精原细胞中的N-甲基-d-天冬氨酸受体结合、增强类固醇生成级联反应中的酶的基因和蛋白质表达、直接影响精原体的有丝分裂活性等方式，在脊椎动物睾丸中精子生成过程中发挥重要作用[10]。甘油磷脂类作为八大脂质中重要的一类，不仅是精子细胞膜的重要组成成分，也对精子间的信号传导起着重要作用，在维持精子获能、顶体反应、精卵结合等关键事件中发挥重要作用[10]。本组资料显示，PM2.5暴露可引起苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸生物合成及鞘脂代谢、甘油磷脂代谢等代谢通路调节异常，导致神经酰胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺等代谢发生改变。当归芍药散可能通过调控甘油磷脂代谢通路，上调磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺等代谢，减轻PM2.5暴露引起的大鼠肺和睾丸组织损伤。

综上所述，PM2.5暴露可引起雄性大鼠多种代谢紊乱，造成睾丸组织损伤，从而影响雄性生殖功能。当归芍药散可通过调控甘油磷脂代谢等多条代谢通路发挥治疗作用，但其具体机制还有待进一步研究。