“环境-遗传-基因互作”模式中磷脂酶Cε1对食管癌易感性的影响

王立东，陈 瑶，徐瑞华，宋 昕，赵学科，李留玉，雷玲玲，周福有，常志伟，吉佳佳，李秀敏，杨媛啧，魏梦霞，王 苒，高社干，鲍启德，胡景峰

1)郑州大学第一附属医院省部共建食管癌防治国家重点实验室 郑州 450052 2)郑州大学基础医学院病理学与病理生理学教研室 郑州 450001 3)安阳市肿瘤医院胸外科 河南安阳 455000 4)新乡医学院新乡市肿瘤分子治疗重点实验室 河南新乡 453003 5)河南科技大学第一附属医院肿瘤内科 河南洛阳 471003 6)安阳地区医院肿瘤内科 河南安阳 455000

随着全基因组关联分析(genome-wide association study,GWAS)和后GWAS研究的深入，越来越多的疾病相关单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)被发现。近年的研究[1-3]提示，部分疾病相关SNP可导致其所在基因以及相关基因转录和蛋白表达水平发生变化，进一步影响肿瘤的发生和发展，甚至影响肿瘤的转归(预后)，这些发现极大丰富了“环境-遗传-基因互作”模式对肿瘤发生、发展和转归影响的新理论；这些SNP可分为增加疾病易感性的SNP和致病性SNP两大类。推测致病性SNP不但影响相关基因的转录和蛋白表达，并且也可能影响驱动基因突变。

本研究团队利用GWAS发现磷脂酶Cε1(phospholipase Cε1，PLCE1)是中国人食管鳞状细胞癌(简称鳞癌)和贲门癌的重要易感基因[4-6]。研究发现，PLCE1不仅与食管癌和贲门癌易感性有关，还与肝癌[7]、胆囊癌[8]等其他消化系肿瘤，甚至皮肤肿瘤[9]、头颈部肿瘤[10]、膀胱肿瘤[11]、肾脏肿瘤[12]等部分消化系外肿瘤易感性有关；不仅与中国人，还与亚洲其他国家食管癌易感性有关[13-14]。PLCE1是磷脂酰肌醇信号通路中的关键酶，激活后可引起一系列生化反应，参与调节细胞生长、增殖、分化、凋亡，影响细胞骨架改变和细胞运动；其可与环境致癌危险因素互作，如人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)16亚型感染等，促进慢性食管炎的发生，进一步影响食管癌的易感性[15-16]。本文就PLCE1对食管癌易感性的影响和作用机制研究现状做一简要阐述，加深对食管癌“环境-遗传-基因互作”分子基础的了解，为筛选高危人群预警和早期发现候选分子标志物提供参考。

1 PLCE1的结构与功能

PLCE1基因定位于常染色体10q23.32～24.1，是一个单拷贝基因，全长334.3 kb，包含34个外显子[16]。PLCE1分子包括保守结构域和特殊结构域两部分。保守结构域为磷脂酶C家族所共有的催化结构域，具有磷脂酶活性，包括XY结构域、PH结构域、EF结构域和C2结构域[17]。各种G蛋白介导的多种上游信号(激素、神经递质、细胞因子、生长因子等)都可汇聚于PLCE1，激活PLCE1，通过水解细胞膜上磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)，产生两种重要的第二信使[三磷酸肌醇(IP3)和二酰基甘油(DAG)]，分别激活IP3/Ca2+和DAG/蛋白激酶C(PKC)细胞信号传导通路，从而引起Ca2+从内质网钙库向细胞质的释放和PKC的激活[17-18]。PKC激活后可引起一系列靶蛋白的丝氨酸和苏氨酸残基磷酸化，从而调节机体代谢。活化的PKC也可促使c-fos、c-jun等基因的反式作用因子磷酸化，加速基因表达，从而促进细胞增殖和分化(图1)[19]。PLCE1特殊结构域包括CDC25和RA(RA1和RA2)结构域，这两个结构域具有鸟嘌呤核苷酸交换活性(GEF)，已经被证实为Ras家族小G蛋白(Ras、Rap1、Rap2)的效应器[16]。CDC25能磷酸化激活Rap1A，进一步激活下游分子引起酶促反应，最后激活细胞外调节蛋白激酶(ERK)途径[20]。活化的RA2与Rap2B结合后可激活PLCE1，诱导细胞内Ca2+浓度升高，最终激活H-Ras，引发丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联反应，活化的MAPK磷酸化诱导核内转录因子转录，促进细胞增殖[21]。Strazza等[22]的研究显示PLCE1介导了由基质细胞衍生因子1α (SDF-1α)/CXC 趋化因子受体 4 (CXCR4) 诱导的T细胞黏附，该过程涉及 Rap1 激活，表明PLCE1在T细胞向炎症部位募集中发挥了重要作用，推测PLCE1可能是一种具有脂肪酶和GEF双重酶功能的蛋白质。绝大多数的小G蛋白都是癌基因编码产物，其在细胞内过度表达或激活可能导致细胞恶变，特别是Ras基因突变可诱发肿瘤。PLCE1作为Ras基因的直接效应因子，可能参与了肿瘤形成过程[23-24]。从上述可以看出，PLCE1作为一种多功能信号蛋白，其在上游受Ras家族GTP酶和G蛋白双向调节，下游除引起钙动员和PKC激活外，还可以作为Ras超家族的鸟嘌呤核苷酸交换因子，活化Ras家族小G蛋白，参与胞内一系列的信号转导，从而发挥各种生物学功能。

图1 磷脂酰肌醇信号通路

本研究团队[4]运用GWAS对2.5万例中国汉族食管鳞癌患者和健康对照进行对比分析，结果显示PLCE1基因rs2274223位点SNP可导致氨基酸由组氨酸转变为精氨酸，上调中国汉族人群食管鳞癌患病风险，进一步研究发现该SNP也可以显著增加新疆哈萨克族和维吾尔族人群食管鳞癌及贲门腺癌的患病风险。PLCE1基因rs2274223位点在基因座上靠近NOC3L基因，而NOC3L基因可以控制有丝分裂点并控制DNA的复制[25]，由此推测该SNP可导致PLCE1 DNA复制并增高其基因表达。

2 PLCE1与慢性食管炎、HPV16互作对食管癌易感性的影响

PLCE1基因rs2274223位点SNP与慢性食管炎关系密切。该SNP可导致从CAC(编码组氨酸)到 CGC(编码精氨酸)的非同义突变。Wang等[26]发现5780G 等位基因与食管癌组织和食管癌细胞系(TE-1、TE-2、TE-7、HCE7、EC109、EC9706、SHEEC等)中PLCE1 mRNA、蛋白表达和酶活性增加有关；此外，对河南食管癌高发区10 614例无症状人群的观察发现：5780G等位基因与中重度慢性食管炎密切相关。Guo等[27]分析了PLCE1和PKCα在人食管炎、甲基苄基亚硝胺诱发的大鼠食管癌变模型、敲除PLCE1基因的小鼠模型和人食管癌细胞系中的表达水平，并结合在线肿瘤学数据集，发现PLCE1表达变化可导致PKCα基因表达改变，二者可协同作用，促进慢性食管炎的发生发展。PLCE1和PKCα的表达在Barrett食管、鳞状上皮细胞炎性改变、食管腺癌和鳞癌及甲基苄基亚硝胺诱发的大鼠食管癌变模型中显著升高；相反，敲除人食管上皮细胞和大鼠PLCE1基因后，上皮细胞中PKCα和一些关键细胞因子(如NF-κB、 IL-1β、IL-6、TNFα、IFN-γ)表达下调。以上发现提示PLCE1和PKCα在食管炎症发展和食管上皮细胞恶变中发挥了重要作用。

HPV感染是重要的食管癌生物致病危险因素。Yang等[28]发现，PLCE1基因rs2274223位点SNP与HPV16感染有明显互作关系；与携带rs2274223位点AA 基因型的HPV16血清阴性者相比，携带AA或AG基因型的 HPV16血清阳性者食管鳞癌患病风险明显升高。还有研究[28-29]发现PLCE1基因rs2274223位点SNP显著增加了食管鳞癌患者对HPV感染的易感性。

这些研究结果提示“环境-遗传-基因互作”模式是食管癌变的重要模式，PLCE1基因rs2274223位点可成为食管癌风险评估的重要液体活检标志物,以此建立起联合PLCE1基因的食管癌高危人群分子分型，可为食管癌高危人群筛查及早期发现提供理论依据和新的思路。

3 PLCE1与PI-PLCE-NF-κB、PKCα/NF-κB和EGFR/PLCE1通路互作对食管癌变的影响

NF-κB信号通路在食管鳞癌发生和进展中发挥了重要作用。Li 等[30]的数据表明 NF-κB在食管鳞癌中被持续激活，参与食管鳞癌发生和进展的关键步骤，包括促进细胞增殖、转移，抗凋亡和血管生成等。另两项研究[31-32]也得出NF-κB在食管鳞癌中被持续激活的结论。表皮生长因子受体(EGFR)信号通路在食管癌的病理生理学中也起了关键作用。Kwak等[33]的研究结果提示EGFR通路与食管癌发生有关，EGFR突变可用于食管癌的分子分型。

PLCE1基因非同义SNP可能导致酶活性异常，最终引起功能改变，从而上调PLCE1 mRNA、蛋白的表达水平；PLCE1过表达的另一种可能机制是食管癌中PLCE1启动子区CpG位点的低甲基化[34]。研究[34-35]证实PLCE1启动子区低甲基化显著上调了 PLCE1 蛋白的表达，后者通过PI-PLCE信号通路激活NF-κB，磷酸化激活p65和IκBα蛋白，磷酸化IκBα可促进p50/p65的核易位。进入细胞核的p65可以直接结合VEGF-C和Bcl-2基因的启动子，增强VEGF-C和Bcl-2表达，从而增强血管生成、抑制细胞凋亡，最终导致食管癌的发生和发展。Chen等[36]观察到低甲基化引起的PLCE1表达上调可以通过MDM2介导的蛋白酶体途径促进P53泛素化和去稳定化，阻断食管癌细胞的自噬，促进食管癌的发生并导致预后不佳；表明PLCE1是MDM2和P53的关键调节剂，在MDM2-P53通路调节中有重要作用。PLCE1位于EGFR通路的下游，Wang等[37]的研究表明EGFR/PLCE1的遗传变异可能是食管鳞癌术后预后的预测因子，具有PLCE1基因rs17109671位点和EGFR基因rs2072454位点CC基因型的个体应该接受更积极的治疗。Zhao等[38]发现PLCE1通过上调Cyclin D1的表达，促进食管癌细胞增殖，下调Caspase-3的表达，从而减少食管癌细胞凋亡。

综上，PLCE1基因既是一个重要的易感基因，同时也具有致病基因的作用, 经与PI-PLCE-NF-κB、PKCα/NF-κB和EGFR/PLCE1通路中多个基因相互作用(图2～4)，促进食管癌的发生和发展。

图2 PLCE1-NF-κB-Ras/MAPK-P53通路

4 展望

越来越多的研究证明，“环境-遗传-基因互作”是食管癌发生的重要分子基础。PLCE1及其介导的信号通路在食管癌发生和多阶段演进过程中的作用机制尚有待更多的研究阐明。环境致癌危险因素与PLCE1协同促进慢性食管炎的发生和发展，并在此过程中引起其他相关基因和蛋白表达变化，最终导致食管上皮癌变。这一“环境-遗传-基因互作”模式尚有待更多的人群队列研究加以证明。这些复杂的互作机制为进一步建立食管癌高危人群预警筛查和早期发现的液体活检关键技术提供了重要候选指标，并为食管癌靶向治疗提供新的研究思路和策略。

图3 PLCE1与Ras相互作用的3D蛋白质结构

图4 PLCE1与食管癌“环境-遗传-基因互作”关系