超高效液相色谱-串联质谱法测定粮食中有机磷酸酯及其二酯代谢物

张博钠，侯敏敏，钱承敬，史亚利*，蔡亚岐

（1.国科大杭州高等研究院（UCAS） 环境学院，浙江 杭州 310024；2.中国科学院生态环境研究中心，环境化学与生态毒理学国家重点实验室，北京 100083；3.中国科学院大学，北京 100049；4.中粮营养健康研究院，营养健康与食品安全北京市重点实验室，北京 102209）

有机磷酸酯（OPEs）作为阻燃剂或增塑剂广泛应用于橡胶制品、纺织品、电子设备、家具及建筑材料等消费品中［1］。近年来，部分卤系阻燃剂（如多溴联苯醚），由于其毒性、长距离迁移性和生物累积性等逐步被淘汰。OPEs 作为替代品，阻燃性能优良，产量和使用量逐年增加。OPEs 通常以物理方式而非化学键合的形式添加于各类消费品中，稳定性较差，因此在消费品生产、运输和使用全过程均可能通过挥发、浸泡溶出或磨损等方式释放到环境中［1］。大量研究显示，目前OPEs 在室内外空气［2-3］、灰尘［4］、沉积物［5］、水体［2］、土壤［6］、生物样本［7］乃至人体样本［8］中检出，表明OPEs 普遍存在于生活环境中，可能会威胁人类健康。

研究表明多种OPEs 对生物体表现出多方面的毒性效应，如神经毒性［9］、生殖毒性［10］、致癌性［11］、内分泌干扰效应［12］等。考虑到OPEs在环境中普遍存在，人体会通过呼吸、灰尘摄食、皮肤吸收、饮食及饮水等多种途径摄入OPEs［13］。目前，多项研究通过采集空气和灰尘样品研究人体通过呼吸和灰尘摄食对OPEs的暴露，仅有少数研究评估了通过饮食摄入对OPEs的暴露［14-16］。Zhang等［14］研究发现食用大米是人体暴露OPEs的潜在的主要途径。粮食及其制品作为人们日常饮食的主食原料，占据人们膳食的重要部分。食用受到污染的粮食可能会影响人体健康。

进入人体的OPEs 能够发生代谢转化，生成其二酯代谢物（di-OPEs）或羟基化的产物［17］，最后通过尿液排出体外，因此通常利用尿液中的OPEs 代谢物作为标志物评估人体对OPEs 的暴露情况［18］。值得注意的是，先前的研究忽略了人体直接从环境和饮食中摄入的OPEs 代谢物。然而最近有研究发现OPEs代谢物本身也存在于食物和灰尘样品中，如Hou等［19］在淡水鱼中检测到OPEs代谢物。He等［20］在澳大利亚采集的食物和饮用水样品中检出磷酸二丁酯（DBP）和磷酸二苯基酯（DPHP）等di-OPEs。Van等［21］研究证实了人们可通过灰尘摄入di-OPEs，表明人体中OPEs代谢物可能直接来源于饮食或灰尘摄食。

目前已有研究在固体样品（如粮食和土壤）中检测到OPEs 及di-OPEs，通过使用不同的分析检测方法，包括固相萃取联用超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）［20，22］、超声提取联用气相色谱-串联质谱（GC-MS）［23］等，但这些研究通常采取不同的前处理方法分别检测OPEs 及di-OPEs，费时费力，且消耗较多有机溶剂。因此，建立同时检测粮食样品中OPEs及di-OPEs的分析方法具有重要意义。

本研究在优化萃取净化前处理条件的基础上，建立了一种同时测定粮食样品中14种OPEs及其8种di-OPEs的UPLC-MS/MS 法。采用该方法对采集的25个小麦样品中目标化合物进行测定，以期了解我国粮食样品中有机磷酸酯及其代谢物的污染水平，并据此对我国成年人和儿童摄入小麦的风险进行评估。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

BJ-150 型多功能粉碎机（德清拜杰电器有限公司）；DHG-9023A 烘箱（上海精宏实验设备有限公司）；KQ-500DB 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；DP200D-1 氮吹浓缩仪（东莞市谱标实验器材科技有限公司）；UltiMate 3000 超高效液相色谱仪（美国Thermo Fisher 公司）；Triple quadTM三重四极杆串联质谱检测系统（MS/MS，美国AB SCIEX 公司）；ENVI-18 固相萃取柱（6 mL/500 mg，Supelco 公司）；HLB 固相萃取柱（6 mL/200 mg，Waters 公司）；0.22 μm 尼龙滤膜（天津市津腾实验设备有限公司）；1 mL 注射器（江苏治宇医疗器械有限公司）。超纯水制备系统（美国Millipore 公司）；甲醇、二氯甲烷、乙腈（色谱纯，美国Fisher公司）。

1.2 标准溶液的配制

OPEs 单标储备液及其内标储备液（1 000 mg/L）用乙腈配制，分别量取10 μL 单标储备液，用乙腈稀释至10 mL，配成质量浓度为1 mg/L 的混合标准储备液和混合内标储备液。di-OPEs 单标储备液及其内标储备液（1 000 mg/L）用甲醇配制，分别量取10 μL 单标储备液，用甲醇稀释至10 mL，配成质量浓度为1 mg/L 的混合标准储备液和混合内标储备液，于-4 ℃储存备用。使用时，用甲醇配制成质量浓度为0.1、0.5、2、5、10、20 μg/L的标准工作溶液。

1.3 样品前处理

称取一定量的小麦置于干净玻璃管中，加入5 mL甲醇后，手动摇晃20 s，取出清洗液，重复2次，清洗后的小麦于80 ℃烘干20 min，粉碎成粉末。准确称取1.0 g粉末样品于15 mL玻璃离心管中，加入质量浓度为1 mg/L 的OPEs 及其代谢物的内标混合溶液各10 μL，静置老化1 h，再加入3 mL 甲醇，超声萃取60 min 后，转移上清液；再向残留部分加入3 mL 甲醇，超声萃取30 min，重复2 次，最后将3次上清液合并待净化。

采用ENVI-18 固相萃取柱对样品进行净化处理，首先用5 mL 甲醇活化萃取柱，将萃取液直接加载到活化好的小柱上并收集，待样品加载完成后，再用5 mL 甲醇进行洗脱，将收集的洗脱液氮吹至1 mL，通过0.22 μm有机滤膜后转移至进样小瓶，待检测。

1.4 仪器条件

1.4.1 色谱条件 色谱柱：Acquity UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；柱温：25 ℃，流速：400 μL/min；流动相：A为5 mmol/L乙酸铵缓冲溶液，B为甲醇。OPEs的梯度洗脱程序：0～1 min，10%～40% B；1～4 min，40%～90% B；4～4.1 min，90%～100% B；4.1～9 min，保持100% B；9～9.1 min，100%～10%B；9.1～13 min，保持10%B。di-OPEs 的梯度洗脱程序：0～0.5 min，保持20%B；0.5～1 min，20%～40%B；1～4 min，40%～90%B；4～7.5 min，保持90%B；7.5～7.6 min，90%～20%B；7.6～12 min，保持20%B。

1.4.2 质谱条件 对于OPEs，离子源：电喷雾离子源正离子模式（ESI+）；检测方式：多重反应监测模式（MRM）；气帘气压力：0.14 MPa，碰撞气压力：0.02 MPa，离子源喷雾电压：5 000 V，温度：600 ℃，雾化气压力：0.34 MPa，辅助雾化气压力：0.28 MPa。对于di-OPEs，离子源：电喷雾离子源负离子模式（ESI-）；检测方式：MRM；气帘气压力：0.07 MPa，碰撞气压力：0.02 MPa，离子源喷雾电压：-4 500 V，温度：500 ℃，雾化气压力：0.34 MPa，辅助雾化气压力：0.34 MPa。其余质谱参数见表1。

表1 14种OPEs及8种di-OPEs的质谱参数Table 1 MS parameters for 14 OPEs and 8 di-OPEs

2 结果与讨论

2.1 净化方法的优化

由于OPEs 及其代谢物的性质存在差异，先前研究通常采用不同的净化方法，对于OPEs，首先用乙腈和超纯水活化ENVI-18 小柱，将换相成水相的萃取液加载到小柱中，上样完成后负压抽干小柱，然后用含有25%二氯甲烷的乙腈溶液进行洗脱（方法1）。对于di-OPEs，首先用甲醇和超纯水活化HLB小柱，将换相成水相的萃取液加载到小柱中，上样完成后负压抽干小柱，用甲醇洗脱目标物（方法2）。上述两种净化方法均需负压抽干柱子，耗时较长，过程较繁琐，且对于同时检测OPEs 以及di-OPEs 需要处理样品2次。因此，本研究对样品净化方法进行了改进，即首先用甲醇活化ENVI-18小柱，然后直接将甲醇相的萃取液加载到活化好的小柱上并收集，然后用甲醇洗脱（方法3）。

实验对比了改进前后净化方法的处理效果（见图1）。结果表明，净化方法1 和3 对于大部分OPEs均具有较好的回收效果，采用净化方法1，除TBOEP 外，其余13 种OPEs 的回收率为90.1%～154%，相对标准偏差（RSD）为8.3%～43%；采用净化方法3，14 种OPEs 的回收率为64.0%～131%，RSD 为0.90%～22%。整体上，采用方法1，TnBP 和TBOEP 的回收率偏高，且RSD 大于方法3。对于di-OPEs，采用方法2 和3，8 种di-OPEs 的回收率分别为79.2%～112%和71.1%～141%，RSD 分别为5.0%～34%和0.57%～19%。鉴于改进后的方法3 对22 种目标化合物均具有较好的回收效果，无需负压抽干小柱，且节约时间，因此最终选择净化方法3，即将甲醇萃取液直接上样进行净化。

图1 不同净化方法对14种OPEs（A）与8种di-OPEs（B）的回收率（n=3）Fig.1 Recoveries of 14 OPEs（A）and 8 di-OPEs（B）using different purifying methods（n=3）

2.2 线性范围、检出限与定量下限

配制质量浓度为0.1、0.5、2、5、10、20 μg/L的14种OPEs和8种di-OPEs的混合标准溶液，按照“1.4”仪器条件进行分析，以待测物的质量浓度为横坐标（x，μg/L），待测物与内标的峰面积比为纵坐标（y）绘制标准曲线。结果表明，14种OPEs和8种di-OPEs在0.1～20 μg/L范围内均表现出良好的线性关系，相关系数（r）大于0.99。分别以3 倍信噪比和10 倍信噪比计算方法检出限（LOD）与定量下限（LOQ），14 种OPEs 的LOD 为0.005 02～1.94 ng/g，LOQ 为0.016 7～6.45 ng/g；8 种di-OPEs 的LOD 为0.005 70～1.00 ng/g，LOQ 为0.018 9～3.33 ng/g（见表2）。在最佳实验条件下，14 种OPEs 及8 种di-OPEs标准溶液的总离子流色谱图见图2。

表2 14种OPEs及8种di-OPEs的线性方程、相关系数、检出限及定量下限Table 2 Linear equations，correlation coefficients，detection limits and quantitation limits of 14 OPEs and 8 di-OPEs

图2 14种OPEs（A）与8种di-OPEs（B）标准溶液的总离子流色谱图Fig.2 Total ion chromatograms of 14 OPEs（A）and 8 di-OPEs（B）standard solutions

2.3 回收率与相对标准偏差

以小麦为基质进行基质加标回收试验以评价方法的准确度与精密度，向其中添加3 个不同浓度水平（5、10、20 μg/L）的混合标准溶液，每个水平平行3 次，按照优化后的方法进行测定。由表3 可知，14 种OPEs 的加标回收率为60.0%～131%，RSD 为0.89%～22%；8 种di-OPEs 的回收率除BBOEP 外（141%），其它均在62.4%～121%之间，RSD 为0.57%～22%。整体上，该方法的准确性较好，精密度较高，能够满足检测要求。

表3 小麦样品中14种OPEs及8种di-OPEs的加标回收率和相对标准偏差（n=3）Table 3 Spiked recoveries and relative standard deviations of 14 OPEs and 8 di-OPEs in wheat samples（n=3）

（续表3）

2.4 实际样品分析与风险评估

采用本方法对25 个小麦样品进行检测，结果见表4。14 种OPEs 的总含量为0.843～23.5 ng/g，中位含量为2.33 ng/g。TEP、TCEP、TCIPP 和EHDPP 在全部样品中均检出，TEHP、TPHP、TMPP 和TBOEP的检出率高于50%。其中，TCIPP是小麦中最主要的OPEs，含量为0.525～2.14 ng/g，中位含量为0.960 ng/g。8 种di-OPEs 的总含量为0.126～4.81 ng/g，中位含量为1.15 ng/g。DBP 和DPHP 在所有样品中均检出，BDCPP 和BEHP 的检出率高于50%。其中BEHP 是小麦中最主要的di-OPEs，中位含量为0.529 ng/g，这可能与其具有直接的工业应用有关。以上结果表明OPEs 和di-OPEs 在小麦样品中普遍存在。

表4 小麦样品中14种OPEs及8种di-OPEs的检测结果（ng/g）Table 4 Detection results of 14 OPEs and 8 di-OPEs in wheat samples（ng/g）

根据Zhang 等［14］采用的风险评估方法，本文评估了我国成年人和儿童通过食用小麦对OPEs 及di-OPEs 的暴露情况。采用下式估算人体每日通过食用小麦对OPEs 及di-OPEs 的摄入量：EDI=CW×CFW/BW。其中：EDI 为每日摄入量，ng/kg bw/day；CW为小麦中OPEs 或di-OPEs 的含量，ng/g；CFW为居民日均小麦消费量，g/day；BW为人体质量，kg。

成人日均小麦消费量取自《中国统计年鉴》［24］，为323 g/day；成人体重取自《中国居民营养与慢性病状况报告（2020 年）》中18 岁及以上居民男性（69.6 kg）和女性（59 kg）体重的平均值，为64.3 kg。儿童（3～12周岁）的平均体重为25 kg，日均粮食消费量（谷物）为165 g/day［25］。

根据美国环保署（USEPA）的定义，RfD 值代表一种化合物每日经口暴露于人体的阈值，被视为人体暴露于非致癌有毒物质风险评估的重要指标。对于我国成年人和儿童，成年人通过食用小麦摄入14种OPEs 的总暴露量为4.23～118 ng/kg bw/day，儿童为5.56～155 ng/kg bw/day；成年人通过食用小麦摄入8 种di-OPEs 的总暴露量为0.633～24.2 ng/kg bw/day，儿童为0.832～31.7 ng/kg bw/day（见表5）。整体上，儿童的暴露量高于成人，TCIPP 是通过食用小麦每日摄入量最高的OPE，估算的儿童和成人的EDI 中位值分别为6.33、4.82 ng/kg bw/day，BEHP 是通过食用小麦每日摄入最高的di-OPE，估算的儿童和成人的EDI中位值分别为3.49、2.66 ng/kg bw/day。每种OPEs通过食用小麦的暴露量比其对应的RfD值低2～5个数量级，表明存在较低的健康风险。但考虑到粮食的生产、加工、运输过程可能会增加OPEs及其代谢物的污染，进而导致人体更高的暴露风险，因此仍需要更多的研究关注人体通过饮食对OPEs及di-OPEs的暴露及相关的健康风险。

表5 成人和儿童通过食用小麦摄入的OPEs及di-OPEs估算结果（ng/kg bw/day）Table 5 Estimation of daily per capita wheat dietary intakes and risk assessment exposure to OPEs and di-OPEs for adults and children（ng/kg bw/day）

3 结 论

本研究建立了超声提取/超高效液相色谱-串联质谱检测粮食样品中有机磷酸酯及其二酯代谢物的分析方法。该方法前处理操作简便，节约时间和溶剂，经过一次处理即可完成所有目标物的浓缩净化，方法学考察表明22种目标物质的回收率良好，重现性高，满足检测要求。基于该方法对实际小麦样品的检测发现，8种OPEs和4种di-OPEs普遍存在，暴露估算结果表明我国成人和儿童通过食用小麦摄入的OPEs远低于其RfD，健康风险较低。