益肠通秘汤对便秘小鼠菌群多样性及肠道Occludin表达的影响

黄 玲,潘 姣,石镇阳,林爱珍

(1. 湖北中医药大学中医临床学院，湖北 武汉 430065；2. 岳阳市人民医院，湖南 岳阳 414100；3. 湖北省中医院，湖北 武汉 430065)

便秘主要以大便干结、排便次数减少和排便困难为主要表现，中老年人多发，不仅影响患者日常生活，严重者还可发展成结肠黑变病、结肠癌等[1]。现代研究已经证明便秘的发病受饮食、遗传、情绪的影响，同时与肠道菌群的关系也十分密切，便秘发生时肠道菌群的多样性破坏、促进肠道蠕动的有益菌减少、破坏肠道屏障功能的致病菌增加[2]。因此如何改善和利用肠道菌群成为了治疗便秘的新靶点。益肠通秘汤是湖北省中医院肛肠科林爱珍教授从医多年治疗便秘的自拟方剂，在临床应用中显示效果良好。但益肠通秘汤能否基于肠道菌群发挥缓解便秘，保护肠道屏障的作用尚未可知。鉴于此，本实验通过建立小鼠便秘模型，针对益肠通秘汤与肠道菌群之间的关系进行了研究。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 8周龄Balb/c小鼠40只，体重18～21 g，由湖北省疾控中心提供，动物合格证号：SYXK2020-0002。恒温、恒湿饲养。动物实验获得湖北省中医院动物伦理委员会批准。

1.2仪器、药物及试剂 荧光显微镜(Leica DMIL显微镜)，烘箱(杭州蓝天仪器有限公司)。益肠通秘汤组成：肉苁蓉15 g、牛膝10 g、当归10 g、升麻10 g、肉桂5 g、制首乌10 g、生白术20 g、枳实10 g、麻仁15 g、黄芪10 g，由湖北省中医院药学实验室提供。按中药常用煎煮要求，加蒸馏水煎汁后浓缩成浓度相当于生药 900 mg/mL 水煎液，于-40 ℃保存备用。莫沙必利购自成都康弘药业集团股份有限公司。免疫组化试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；紧密连接蛋白(Occludin)抗体购自Santa Cruz Biotechnology，按1∶200稀释；活性炭和洛哌丁胺购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.3实验方法 将40只Balb/c小鼠随机分为正常组、便秘组、益肠通秘汤组、莫沙必利组，每组10只。适应性喂养1周后，便秘组、益肠通秘汤组和莫沙必利组连续每日皮下注射洛哌丁胺10 mg/kg 2周建立便秘模型。第3周开始，益肠通秘汤组给予益肠通秘汤14 g/(kg·d)(按临床常用剂量换算)灌胃，莫沙必利组给予枸橼酸莫沙必利5 g/(kg·d)(参考文献[3]确定剂量)灌胃，正常组及便秘组给予等量生理盐水灌胃，均持续2周。

1.4观察指标

1.4.1粪便数量及粪便含水量 灌胃实验结束前，分别收集单只小鼠3 h内新鲜粪便，计数并称重，60 ℃干燥12 h后再次称重，计算粪便数量及粪便含水量。

1.4.2活性炭推进长度和肠道推进率 末次灌胃结束后，每组随机选取5只小鼠，均灌胃0.2 mL 10%活性炭，30 min后将小鼠麻醉处死，取胃及小肠组织，测量小肠的全长及活性炭在小肠所经过的最远距离即活性炭推进长度，计算每只小鼠的肠道推进率。肠道推进率=活性炭推进长度/小肠全长×100%。

1.4.3肠道菌群测序 收集每组剩余小鼠结肠内容物，通过16S rDNA的V3～V4区扩增片段进行二代高通量核酸测序，分析肠道菌群的组成、物种丰富度、多样性等。按照Fast DNATMSPIN Kit(MP Biomedicals)的方案提取粪便样本的基因组DNA，用于扩增16S rDNA基因的V3～V4高变异区，测序由北京全威基因科技有限公司在Illumina MiSeq平台(Illumina, San Diego)上进行。

1.4.4结肠上皮中Occludin表达情况 取每组剩余小鼠结肠组织，4%多聚甲醛固定结肠组织上端，常规脱水石蜡包埋切片后进行免疫荧光染色，在荧光显微镜下观察结肠黏膜中Occludin表达情况并拍照记录。

2 结 果

2.1各组小鼠粪便数量及粪便含水量比较 便秘组小鼠粪便数量及粪便含水量均明显低于正常组(P均<0.05)；益肠通秘汤组和莫沙必利组小鼠粪便数量和粪便含水量均明显高于便秘组(P均<0.05)，且益肠通秘汤组均明显高于莫沙必利组(P均<0.05)。见表1。

表1 正常组和便秘各组小鼠粪便数量及粪便含水量比较

2.2各组小鼠活性炭推进长度和肠道推进率比较 各组小鼠小肠总长比较差异无统计学意义(P>0.05)；便秘组小鼠活性炭推进长度和肠道推进率均明显低于正常组(P均<0.05)，益肠通秘汤组小鼠活性炭推进长度、肠道推进率及莫沙必利组小鼠肠道推进率均明显高于便秘组(P均<0.05)，且益肠通秘汤组小鼠肠道推进率明显高于莫沙必利组(P<0.05)，莫沙必利组小鼠小鼠活性炭推进长度与便秘组及益肠通秘汤组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表2。

表2 正常组和便秘各组小鼠活性炭推进长度和肠道推进率比较

2.3各组小鼠肠道菌群情况

2.3.1结肠粪便中菌群α多样性 便秘组小鼠Chao1和shannon水平均明显低于正常组(P均<0.05)，益肠通秘汤组小鼠Chao1和shannon水平均明显高于便秘组(P均<0.05)，莫沙必利组小鼠Chao1和shannon水平与便秘组及益肠通秘汤组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图1。

图1 正常组和便秘各组小鼠肠道菌群α多样性Chao1和shannon水平

2.3.2结肠粪便菌群属水平细菌相对丰度 便秘组小鼠结肠粪便中Lactobacillus、Bifidobacterium、Prevotella和Akkermansia相对丰度均明显低于正常组(P均<0.05)，Coprococcus和Clostridium相对丰度均明显高于正常组(P均<0.05)。益肠通秘汤组小鼠结肠粪便中Lactobacillus、Bifidobacterium、Prevotella和Akkermansia相对丰度均明显高于便秘组(P均<0.05)，Coprococcus和Clostridium相对丰度均明显低于便秘组(P均<0.05)；莫沙必利组结肠粪便中Lactobacillus、Bifidobacterium、Prevotella、Akkermansia、Coprococcus和Clostridium相对丰度与便秘组及益肠通秘汤组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图2。

图2 正常组和便秘各组小鼠肠道菌群属水平代表细菌相对丰度

2.4各组小鼠结肠上皮Occludin表达情况 便秘组小鼠结肠上皮中Occludin表达较正常组少；益肠通秘汤组和莫沙必利组Occludin表达较便秘组多，但莫沙必利组略少于益肠通秘汤组。见图3。

图3 正常组和便秘各组小鼠结肠上皮紧密连接蛋白Occludin表达情况(免疫荧光染色)

3 讨 论

中医学将“便秘”分为虚秘和实秘。《中医内科学》将实秘的病机归纳为胃肠积热、气机郁滞和阴寒积滞，而虚秘主要是由气、血、阴、阳的亏虚引起。目前临床多发的便秘与脾虚中气弱而肠道推动功能不足和肾虚阳气弱而温煦肠道能力下降密切相关。益肠通秘汤加减方具有温肾健脾、益肠通便的攻补兼施作用，临床上对多种类型便秘均有治疗作用，尤其是对脾肾阳虚型便秘效果显著。

现代研究认为，脾虚型疾病多伴随肠道菌群的多样性减少，肠道菌群的失调会导致功能性便秘，便秘的发生也会引起肠道菌群紊乱[4-5]。肠道菌群中的产芽孢厌氧菌和双歧杆菌能够促进胃肠道的蠕动，改善肠道内免疫环境，缓解便秘[6]，乳酸杆菌、乳酸球菌、双歧杆菌等多种细菌的减少可促进慢性便秘的发展[7]。便秘患者菌群测序分析显示，有益菌如Lactobacillus、Bifidobacterium、Prevotella、Akkermansia相对丰度低于正常人群，而有害菌如Coprococcus和Clostridium相对丰度明显增加[8]。丁洪汇[9]报道，加味半夏泻心汤联合莫沙必利能纠正便秘型肠易激综合征和功能性消化不良重叠患者肠道微生态紊乱,重建肠道菌群平衡,改善胃肠功能。王琳琳等[10]研究发现，副干酪乳杆菌LPC-F可通过促进结肠Cajal间质细胞的增殖，增强肠蠕动，缓解便秘症状。

本研究采用洛哌丁胺灌胃方法建立小鼠便秘模型，结果显示益肠通秘汤和莫沙必利均能改善小鼠粪便含水量和肠道推进率，促进肠道菌群的多样性恢复，增加有益菌Lactobacillus、Bifidobacterium、Prevotella、Akkermansia的相对丰度，降低有害菌Coprococcus、Clostridium的相对丰度，但益肠通秘汤对小鼠粪便含水量、肠道推进率及肠道菌群的改善作用较莫沙必利强。这可能由于莫沙必利是促进胃肠动力药物，其主要通过推进食物残渣的运动、减少粪便在结肠的停留时间和水分重吸收而治疗便秘；而益肠通秘汤中含有的肉苁蓉、黄芪、火麻仁具有改善肠道菌群、增加双歧杆菌等益生菌数量、抑制有害菌的侵害作用[11-13]，这些药物联合应用使调节肠道菌群、促进菌群多样性恢复的作用更加明显。

Occludin与便秘关系非常密切，Occludin的降解会导致肠道组织紧密连接结构的破坏，导致便秘的发生，而且这种改变只发生在蛋白水平上，mRNA水平并没有明显改变[14-15]。便秘发生时，Occludin不仅直接被腔内蛋白酶降解，而且肠道菌群中有害菌的破坏作用可以直接影响Occludin的表达，增加肠腔内益生菌的丰度可以维持肠道包括Occludin在内的紧密连接蛋白结构，从而增强肠道屏障功能[8]，而肠屏障功能与肠功能之间存在正相关的关系[16]。本实验结果显示，益肠通秘汤可增加肠道中Occludin 的表达，证实了肠道菌群对肠屏障功能的保护作用。

综上所述，益肠通秘汤可能是通过影响肠道菌群和肠道屏障功能而起到防治便秘的作用，但中药组方的作用途径、靶点复杂，其作用机制还有待进一步探讨。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。