耳电针缓解功能性消化不良大鼠胃部高敏的效应规律及对神经生长因子的影响

周静珠，程宏亮，陈 欢，徐万里，朱伟坚，周 帅，张朝晖

(1. 南京医科大学第一附属医院，江苏 南京 210029；2. 南京中医药大学附属医院，江苏 南京 210029)

慢性内脏痛是功能性消化不良(functional dyspepsia，FD)患者最常见的症状之一，其中内脏高敏是FD慢性内脏痛关键机制之一[1-3]。神经生长因子(NGF)在启动以及长期加剧炎症反应的疼痛敏感性中起着关键作用，其能引起传入神经敏化，从而引起内脏高敏[4]。相关实验研究发现，幼年大鼠的肠道轻度炎症刺激可引起成年后出现自主神经功能紊乱，交感神经活性增加而迷走神经低张，血浆去甲肾上腺素(NE)水平升高，胃底部肌层NGF表达上调，继而出现内脏高敏[5]。在FD患者中也检测到胃底部NGF mRNA表达升高[6]。目前内脏痛的治疗手段非常有限且效果不佳，长期服用镇痛药物易出现成瘾性，并可能出现继发性消化道损伤。耳穴疗法是祖国传统外治疗法，广泛运用临床各科疾病。基于耳郭上独特的体表迷走神经耳支分布，耳穴疗法可以通过刺激耳迷走神经来调控内脏感觉、运动[7-8]。耳迷走神经主要分布在耳郭的耳甲区，本课题组前期研究显示单次耳电针耳甲区“胃”穴可以有效缓解FD大鼠内脏高敏，且此效应与调节迷走神经功能密切相关[9]。本研究通过建立幼鼠三硝基苯磺酸灌肠诱导FD胃部高敏模型，观察肌电图、动物行为学、血浆NE、胃底NGF mRNA和蛋白表达情况，进一步研究了耳电针的效应规律及机制。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 购入SPF级别孕鼠[辽宁长生生物技术股份有限公司，许可证号：SCKX(辽)2020-0001]，选取新生雄性大鼠进入实验。实验动物饲养条件为室温22～24 ℃，湿度50%，光照周期12 h/12 h，母鼠自由进食，幼鼠与母鼠同笼饲养。本研究获得《南京医科大学实验动物福利伦理委员会》审查同意(IACUC-2004001)。

1.2主要试剂及仪器 华佗牌一次性无菌针灸针(0.25 mm×25 mm，苏州医疗用品厂有限公司，中国)，电针仪(CMNS6-2型，无锡佳键，中国)；肌电图电极线(A&E Medical,Farmingdale,NJ,美国)；肌电图放大器(EMG 100C;Biopac systems,Inc,Santa Barbara,CA,美国)；大鼠NE酶联免疫分析试剂盒(MM-20302R1，酶免，中国)；酶标仪(Multiskan FC，Thermo，美国)；低温离心机(D3024R，SCILOGEX，美国)；Real time PCR仪(TL998-IV，天隆科技，中国)；梯度PCR仪(TC1000-G，SCILOGEX，美国)；DYCZ-24DN型垂直电泳装置(北京市六一仪器厂，中国)；RIPA裂解液，BCA试剂盒、GAPDH polyclonal antibody、NGF Rabbit pAb(南京恩晶生物，中国)。

1.3实验方法 按照实验目的，为了减少实验操作对观察指标的影响，分为2部分实验。

1.3.1实验一 将16只10 d龄雄性幼鼠随机分为对照组和耳电针组，每组8只。耳电针组幼鼠参照文献[4]制备FD胃部高敏模型：用1 mL注射器抽取配置好的三硝基苯磺酸(TNBS)/乙醇灌肠溶液(用量为130 mg/kg，溶解入含10%乙醇的生理盐水0.2 mL中)，然后将1 mL注射器连接2 cm的细软管插入幼鼠远端结肠灌肠，灌肠后保持头朝下位置2 min，以防止液体流出。对照组幼鼠灌入等量生理盐水。造模后，所有幼鼠与母鼠继续共同饲养。2组大鼠第7周龄时，埋置胃部气囊(腹腔注射2%戊巴比妥钠30 mg/kg麻醉后进行腹部剃毛，用外科刀片做前正中切口，打开腹腔，找到胃底，做荷包缝合，用眼科剪剪开小口，插入气囊，连接气囊的PE管从肌肉层穿出到皮下走行至颈部出)和颈部肌电图检测电极(于大鼠颈部一侧肩峰下斜方肌埋置一对肌电图电极，电极线留在颈部与PE管一起穿出)，恢复1周后，第8周龄进入实验。对照组大鼠不做特殊处理；耳电针组大鼠接受电针耳穴刺激：采用2.0%～2.5%异氟烷吸入麻醉后，将大鼠放入特定装置固定，麻醉清醒后开始电针治疗。参照人体耳穴分布，选用双侧耳穴“胃”穴(参照人体的耳穴“胃”，属于耳迷走神经分布区)[9-10]。针刺后连接电针，电针参数：2 Hz，连续波，1.0～1.5 mA(以大鼠耳部微微颤动为度)。每次治疗30 min，每日1次，连续5次。

1.3.2实验二 将40只10 d龄雄性幼鼠随机分为对照组、模型组、耳电针组、电针对照组，每组10只。除对照组外，其余组幼鼠均按照实验一中方法建立FD胃部高敏模型。各组大鼠第8周龄进入实验，耳电针组按照实验一中方法进行电针，电针对照组选取双侧大鼠耳垂进行电针(其余操作同耳电针组)，每次治疗30 min，每日1次，连续5次。对照组和模型组大鼠不做针刺干预，每日抓取固定于特殊装置内，连续5 d。

1.4检测指标及方法

1.4.1实验一 分别记录2组大鼠第8周龄时(电针干预前)颈部斜方肌肌电积分、腹部回撤反射评分和耳电针组单次耳电针后(即时效应)、5次耳电针后(累加效应)及耳电针结束后第3，5，10天(维持效应)颈部斜方肌肌电积分。①肌电检测方法：将肌电图电极连接肌电图记录仪，用三通管分别连接胃部气囊的PE管、血压计和血压计气囊，测定在不同压力下(20，40，60，80 mmHg，1 mmHg=0.133 kPa)肌电图的数值，通过肌电分析软件自动对原始数据进行滤波降噪处理，数据归一化与统计分析。②腹部回撤反射评分方法及标准：将大鼠放于特定的透明固定器，使之能自由活动而便于观察。给予大鼠胃部气囊充气后进行不同压力(20，40，60，80 mmHg)刺激，引起大鼠的疼痛。0分：对胃部扩张无反应；1分：有动作停顿后出现短暂的头部运动行为；2分：可见腹部肌肉收缩；3分：有腹部抬起行为；4分：身体拱起，并抬起盆腔和阴囊[11]。

1.4.2实验二

1.4.2.1胃壁和肠壁病理形态 各组大鼠在相应处理5 d结束后，给予巴比妥钠100 mg/kg腹腔注射麻醉，迅速开腹，取胃底部和远端结肠，用10%福尔马林固定，脱水，石蜡包埋，切片经HE染色，光学显微镜下观察胃壁和肠壁有无结构改变。

1.4.2.2血浆NE水平 心脏取血，按照ELISA说明书检测血浆NE水平。

1.4.2.3胃底组织中NGF mRNA表达情况 采用RT-PCR法检测：TRIzol试剂盒提取胃底组织内总RNA，反转录合成cDNA。引物序列：β-actin上游5’-TGCTATGTTGCCCTAGACTTCG-3’，下游5’-GTTGGCATAGAGGTCTTTACGG-3’；NGF上游5’-CCAGAGGCGGGGTTTCAT-3’，NGF下游5’-TGAGACACTCGCTCAGCTTC-3’。反应体系：2×qPCR MasterMix 10 μL，Forward Primer 0.6 μL，Reverse Primer 0.6 μL，模板1 μL，Nuclease-FreeWater 7.8 μL。反应条件：95.0 ℃ 10 min；95.0 ℃ 5 s，60.0 ℃ 30 s，40个周期；熔解曲线：60～95.0 ℃，0.5 ℃，5 s/次。按照2-△△Ct相对定量计算公式计算目的基因相对表达量。

1.4.2.4胃底组织中NGF蛋白表达情况 采用Western blot法检测：取-80 ℃冰冻的胃底组织，匀浆、裂解、离心后取上清液，采用BCA蛋白定量法检测蛋白浓度，配制SDS变性聚丙烯酰胺凝胶，将蛋白样品与5×上样缓冲液混合后，煮沸变性5 min，冰浴5 min。上样，10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，4 ℃ 350 mA恒流转膜2 h，将膜置于1×孵育封闭液中，室温摇动封闭2 h，加一抗孵育封闭液中，4 ℃摇动过夜。洗膜4次，加二抗孵育封闭液中，室温作用1.5 h，洗膜4次后显影机中显影。使用Image J测量灰度值，以目的蛋白与内参GAPDH灰度值的比值作为相对表达量。

2 结 果

2.1实验一中2组大鼠肌电积分和腹部回撤反射评分比较 胃部球囊扩张压力为40，60和80 mmHg时，耳电针组大鼠第8周龄电针前的肌电积分均明显高于对照组(P均<0.05)；胃部球囊扩张压力为60和80 mmHg时，耳电针组大鼠第8周龄电针前的腹部回撤反射评分均明显高于对照组(P均<0.05)。见图1。

图1 不同胃部球囊扩张压力下2组大鼠第8周龄时肌电积分和腹部回撤反射评分

2.2实验一中耳电针组大鼠不同时间点肌电积分比较 胃部球囊压力为20和40 mmHg时，单次耳电针后、5次耳电针后、耳电针结束后第3，5，10天的肌电积分与第8周龄电针前的肌电积分比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。胃部球囊扩张压力为60和80 mmHg时，单次耳电针后的肌电积分均明显低于第8周龄电针前(P均<0.05)；5次耳电针后的肌电积分均明显低于单次耳电针后(P均<0.05)；耳电针结束后第3天的肌电积分与5次耳电针后比较差异均无统计学意义(P均>0.05)；耳电针结束后第5天的肌电积分均明显高于5次耳电针后(P均<0.05)，仍明显低于第8周龄电针前(P均<0.05)；耳电针结束后第10天的肌电积分均明显高于5次耳电针后(P均<0.05)，与第8周龄电针前比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图2。

图2 不同胃部球囊扩张压力下耳电针组大鼠不同时间点肌电积分

2.3实验二中各组大鼠胃底、远端结肠HE染色形态 胃底HE染色显示：对照组大鼠胃底部黏膜层被覆单层柱状上皮，排列整齐，固有层内有胃腺，胃腺颈部可见少量黏液细胞，各部位未见明显病变；各造模组大鼠胃壁组织结构同对照组，黏膜层上皮细胞无变性坏死，胃腺颈部黏液细胞数量轻度增多，固有层无增多的炎细胞，黏膜下层无充血、水肿，无炎细胞浸润，肌层细胞无变性坏死，见图3。远端结肠HE染色显示：对照组和各造模组大鼠远端结肠黏膜上皮细胞无变性、坏死，黏膜固有层和黏膜下层无充血、水肿，无炎细胞浸润，肌层、浆膜层无炎细胞浸润或其他病变。见图4。

图3 对照组和胃部高敏各组大鼠胃底组织病理形态(HE染色，×200)

图4 对照组和胃部高敏各组大鼠结肠组织病理形态(HE染色，×200)

2.4实验二中各组大鼠血浆NE水平比较 模型组和电针对照组大鼠血浆NE水平均明显高于对照组(P均<0.05)，耳电针组大鼠血浆NE水平均明显低于模型组与电针对照组(P均<0.05)。见图5。

图5 对照组和胃部高敏各组大鼠血浆NE水平

2.5实验二中各组大鼠胃底组织中NGF mRNA及蛋白表达情况比较 模型组和电针对照组大鼠胃底组织中NGF mRNA和蛋白相对表达量均明显高于对照组(P均<0.05)，耳电针组大鼠胃底组织中NGF mRNA和蛋白相对表达量均明显低于模型组和电针对照组(P均<0.05)。见图6及图7。

图6 对照组和胃部高敏各组大鼠胃底组织中NGF mRNA相对表达量

图7 对照组和胃部高敏各组大鼠胃底组织中NGF蛋白表达情况

3 讨 论

《灵枢·口问》中记载：“耳者，宗脉之所聚也。”耳与诸多经络有连属关系，刺激耳穴可调和阴阳和脏腑功能。诸多研究表明，耳郭上分布着人体唯一的体表迷走神经，刺激耳迷走神经分布区可以激活大脑相关通路，从而激活迷走神经传出支配内脏的纤维，对内脏功能起调节作用[7-8]。本课题组前期研究显示，耳电针可通过改善迷走神经活性，缓解FD内脏高敏，即时效应明显[9]。

诸多研究表明，针灸镇痛具有累加效应和长时程维持效应[10-11]。李为民等[12]采用电针“足三里”和“上巨虚”干预肠易激综合征大鼠内脏痛，结果显示单次电针5 min后即开始显现镇痛效应，20～30 min后达到高峰，能维持20～90 min；且多次电针疗效优于单次电针，停止电针后镇痛效应仍可以维持一段时间。吴鎏桢等[13]研究表明，电针刺激对大鼠吗啡戒断症状的抑制作用有累加效应，多次治疗后抑制效应可维持1周。基于上述研究结果，本实验设计了耳电针的疗效观察时间点，采用较为成熟的FD内脏高敏大鼠模型，进一步观察了耳电针的累加效应和维持效应。FD内脏高敏模型的特点是在大鼠幼年时期给予远端结肠炎症刺激，在大鼠成年后表现出功能上的内脏高敏，而胃黏膜和结肠黏膜无明显的炎症反应，这与临床上FD的诊断相符合[14]。本实验通过肌电检测证实成功复制了非炎症性的内脏高敏模型，胃、结肠黏膜病理观察证实幼年造模未对成年大鼠胃肠及远端结肠造成炎症反应。耳电针的效应研究结果显示，5次耳电针的累加镇痛效应明显优于单次的即时效应，且电针结束后第3天镇痛效应仍维持较好；在电针结束后第5天效应虽有减弱，但仍具有镇痛效应；在电针结束后第10天效应衰减，镇痛效应不明显。提示给予FD大鼠耳电针，可有效缓解胃部高敏，即时效应明显，5次耳电针治疗的累加效应显著，且有一定的维持效应。

NGF具有神经元营养和促突起生长双重生物学功能，是一种神经细胞生长调节因子。NGF对中枢及周围神经元的发育、分化、生长、再生和功能特性的表达均具有重要的调控作用[15]，其与内脏高敏关系密切[16-18]。相关研究显示，内脏痛大鼠外周组织中NGF表达升高[4，16，19]；大鼠新生期结肠刺激可导致成年后结肠组织中NGF表达升高，引起感觉神经元电生理改变，致肠易激综合征内脏高敏感[20]；早期的母婴分离可引起成年后肠神经系统可塑性改变，通过阻断NGF信号通路可部分缓解内脏高敏[21]。本实验结果表明，模型组大鼠血浆NE水平、胃底组织中NGF mRNA和蛋白表达量均明显高于对照组，说明幼年时期的结肠炎症刺激可导致成年后大鼠胃底组织中NGF表达增高，这可能与血浆NE水平升高有关。因为幼年时期的结肠炎症刺激，可上调在腹腔神经节的酪氨酸羟化酶水平，从而促进胃底肌层外的NE释放，NE增加会依赖性地上调NGF，NGF成比例地增加胃扩张的内脏运动反应[19]。耳电针组大鼠血浆NE水平、胃底组织中NGF mRNA和蛋白表达量均明显低于模型组，说明耳电针可抑制NE释放，下调NGF表达，这可能是耳电针缓解内脏高敏的机制之一。

综上所述，耳电针可缓解FD内脏高敏，多次干预效果更显著，且有一定的维持效应，其缓解效应可能与调控血浆NE和胃底组织NGF的表达有关。本实验结果为耳穴疗法调节功能性胃肠病提供了客观依据，有利于耳穴疗法在临床中的推广运用。但本实验未观察该疗法对大鼠胃排空及其他相关症状的影响，机制研究比较局限，未进行中枢机制及相关通路的探讨，有待进一步研究。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。