健脾补肾方对辐射损伤小鼠全血细胞及免疫器官的影响研究

何东初，肖静静，张梦云，张 勇，丁晓娟，伍 伟，杨文超

(中部战区总医院，湖北 武汉 430070)

电离辐射可导致机体多系统损伤，其中造血及免疫系统对电离辐射高度敏感，损伤后易导致病情进展及预后不良[1-2]，故辐射后造血功能的恢复以及免疫功能的重建是治疗的关键。目前，临床上常用的电磁辐射防治方法包括电磁屏蔽装置物理防护、生物治疗、化学药物治疗等，其中防护效果好的却存在明显不良反应而限制了其广泛应用[3-4]。近年来，中医药凭借整体观念和辨证施治的优势，在电磁辐射损伤防治中取得了显著疗效，从中医药角度寻求辐射防治策略成为辐射领域研究的热点[5-6]。健脾补肾方是防治辐射损伤的经验方，前期临床研究表明该方能够显著改善白细胞减少症、血虚证及肿瘤放疗损伤患者的造血和免疫功能[7]；基础研究表明健脾补肾方的防辐射损伤机制涉及减轻氧化损伤[8]，调控Wnt信号通路[9-10]，调节细胞增殖与凋亡基因、细胞黏附分子表达等方面[11-12]。本研究在前期工作基础上，通过对比观察辐射后以及健脾补肾方干预后外周血细胞和免疫器官的动态变化，从而更系统更全面地了解辐射对机体的损伤效应及健脾补肾方的治疗效应，为辐射损伤防治提供新的治疗手段。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 清洁级昆明种小鼠90只，体重18～22 g，雌雄各半，由湖北省实验动物研究中心提供，动物合格证号：42000600035569，饲养条件：SPF级别。本实验经广州军区武汉总医院医学实验动物福利伦理委员会审核通过[武总动(福)第2018003号]。

1.2药物制备 健脾补肾方由熟地黄30 g、炙甘草15 g、当归6 g、黄芪30 g、泽泻9 g、陈皮10 g组成，由中国人民解放军中部战区总医院制剂室制备，经水煎、过滤、浓缩后，制成生药浓度1 g/mL和2 g/mL的药液，分装备用。胸腺肽肠溶片：西安迪赛生物药业有限公司，国药准字H19991177，规格：30 mg/片。

1.3主要试剂及仪器 轮转式组织切片机(rm2016)，德国Leica公司；生物组织摊烤片机(JK-6)，武汉俊杰公司；生物显微镜(BX53)，奥林巴斯公司；迈瑞兽用全自动血液分析仪(BC-2800vet)；电子天平(CPA)，北京赛多利斯仪器系统有限公司；苏木素染液(货号：H967)，Sigma公司；水溶性伊红染液(货号：71014544)、无水乙醇(10009218)、二甲苯溶液(货号：10023418)、包埋石蜡(货号：69019361)、中性树胶(货号：10004160)，国药集团。

1.4实验方法 90只小鼠适应性喂养1周后，随机选择18只作为正常组，其余小鼠采用一次性给予直线加速器6.0 Gy X射线全身照射，剂量率为450仑，以小鼠食欲下降、活动减少、白细胞计数与正常小鼠比较明显下降为造模成功标准。将造模成功小鼠按随机数字表法分为模型组、健脾补肾方小剂量组、健脾补肾方大剂量组、胸腺肽组，每组18只。健脾补肾方小剂量组给予1 g/mL健脾补肾方灌胃，健脾补肾方大剂量组给予2 g/mL健脾补肾方灌胃，胸腺肽组给予胸腺肽肠溶片混悬液0.325 mg/mL灌胃，正常组和模型组给予生理盐水灌胃，灌胃量均为0.2 mL/10 g，2次/d。

1.5检测指标及方法 每组分别于灌胃第7，14，30天各随机取6只小鼠称体重，收集外周血，分离脾脏、胸腺并称重。

1.5.1外周血细胞测定 各组小鼠外周血用EDTA抗凝，取20 μL进行20倍稀释，用血细胞计数仪检测白细胞计数、淋巴细胞计数、红细胞计数、血红蛋白含量、血小板计数。

1.5.2胸腺和脾脏指数测定 采用以下公式计算各组小鼠胸腺和脾脏指数：胸腺指数=[胸腺重量(mg)/小鼠体重(g)]×10；脾脏指数=[脾脏重量(mg)/小鼠体重(g)]×10。

1.5.3脾脏组织病理学观察 取各组小鼠经4%多聚甲醛固定的脾脏组织，置于常规梯度酒精中脱水，二甲苯透明后进行石蜡包埋，切片，HE染色，风干后中性树胶封片，镜检采集照片。

2 结 果

2.1各组小鼠不同时间点外周血白细胞计数比较模型组灌胃第7天白细胞计数较正常组大幅度降低(P<0.05)；灌胃第14天和第30天白细胞计数略有回升，但仍明显低于正常组(P均<0.05)。各药物组灌胃第7天、第14天、第30天白细胞计数均明显高于同期模型组(P均<0.05),且健脾补肾方小剂量组、胸腺肽组灌胃第14天、第30天白细胞计数均明显高于同期健脾补肾方大剂量组(P均<0.05)。灌胃第30天，健脾补肾方小剂量组、胸腺肽组白细胞计数已恢复正常，与正常组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1 正常组和辐射损伤各组小鼠白细胞计数比较

2.2各组小鼠不同时间点外周血淋巴细胞计数比较 模型组灌胃第7天淋巴细胞计数较正常组大幅度降低(P<0.05)；灌胃第14天和第30天淋巴细胞计数略有回升，但仍明显低于正常组(P均<0.05)。灌胃第7天，健脾补肾方小剂量组和胸腺肽组淋巴细胞计数均明显高于模型组及健脾补肾方大剂量组(P均<0.05)，健脾补肾方大剂量组与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)；灌胃第14天、第30天，各药物组淋巴细胞计数均明显高于模型组(P均<0.05)，且健脾补肾方小剂量组灌胃第14天淋巴细胞计数明显高于健脾补肾方大剂量组(P均<0.05)；灌胃第30天，健脾补肾方小剂量组、胸腺肽组淋巴细胞计数恢复正常，与正常组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表2。

表2 正常组和辐射损伤各组小鼠淋巴细胞计数比较

2.3各组小鼠不同时间点外周血红细胞计数比较模型组灌胃第7天红细胞计数较正常组大幅度降低(P<0.05)，灌胃第14天仍持续下降(P<0.05)；灌胃第30天略有回升，但仍明显低于正常组(P<0.05)。灌胃第7天，健脾补肾方小剂量组红细胞计数明显高于模型组(P<0.05)，与正常组比较差异无统计学意义(P>0.05)，健脾补肾方大剂量组、胸腺肽组红细胞计数与模型组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)；灌胃第14天，健脾补肾方大剂量组、胸腺肽组红细胞计数均明显高于模型组(P均<0.05)，但仍明显低于正常组和健脾补肾方小剂量组(P均<0.05)，健脾补肾方小剂量组红细胞计数维持正常水平；灌胃第30天，各药物组红细胞计数均恢复正常，与正常组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表3。

表3 正常组和辐射损伤各组小鼠红细胞计数比较

2.4各组小鼠不同时间点外周血血红蛋白含量比较 模型组灌胃第7天血红蛋白含量较正常组大幅度降低(P<0.05)，灌胃第14天仍持续下降(P<0.05)；灌胃第30天略有回升，但仍明显低于正常组(P<0.05)。各药物组灌胃第7天、第14天、第30天血红蛋白含量均明显高于同期模型组(P均<0.05),其中健脾补肾方小剂量组灌胃第7天血红蛋白含量均明显高于健脾补肾方大剂量组和胸腺肽组(P均<0.05)，与正常组比较差异无统计学意义(P>0.05)；健脾补肾方小剂量组和胸腺肽组灌胃第14天血红蛋白含量与正常组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)；灌胃第30天，各药物组血红蛋白含量与正常组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表4。

表4 正常组和辐射损伤各组小鼠血红蛋白含量比较

2.5各组小鼠不同时间点外周血血小板计数比较模型组灌胃第7天血小板计数较正常组大幅度降低(P<0.05)，灌胃第14天仍持续下降(P<0.05)；灌胃第30天略有回升，但仍明显低于正常组(P<0.05)。各药物组灌胃第7天、第14天、第30天血小板计数均明显高于同期模型组(P均<0.05),其中健脾补肾方小剂量组均明显高于同期健脾补肾方大剂量组和胸腺肽组(P均<0.05)，且灌胃第14天和第30天血小板计数与正常组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表5。

表5 正常组和辐射损伤各组小鼠血小板计数比较

2.6各组小鼠不同时间点胸腺指数比较 模型组灌胃第7天胸腺指数较正常组明显降低(P<0.05)，灌胃第14天、第30天仍持续降低(P均<0.05)。各药物组灌胃第7天、第14天、第30天胸腺指数均明显高于同期模型组(P均<0.05),但均明显低于正常组(P均<0.05)；健脾补肾方小剂量组灌胃第30天胸腺指数明显高于健脾补肾方大剂量组(P<0.05)。见表6。

表6 正常组和辐射损伤各组小鼠胸腺指数比较

2.7各组小鼠不同时间点脾脏指数比较 模型组灌胃第7天脾脏指数较正常组明显降低(P<0.05)；灌胃第14天稍有回升，灌胃第30天再次下降，且均明显低于正常组(P均<0.05)。各药物组灌胃第7天、第14天、第30天脾脏指数均明显高于同期模型组(P均<0.05)，其中第14天各组脾脏指数与正常组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)，第30天健脾补肾方大剂量组脾脏指数明显低于正常组(P<0.05)，健脾补肾方小剂量组、胸腺肽组与正常组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表7。

表7 正常组和辐射损伤各组小鼠脾脏指数比较

2.8各组小鼠不同时间点脾脏形态学表现 正常组小鼠脾脏组织中白髓、红髓结构清晰完整。模型组小鼠灌胃后第7天脾小体结构消失，大量淋巴细胞浸润，结缔组织增生；灌胃后第14天和第30天，病理改变较前略减轻。各药物组小鼠脾脏病理改变均较模型组有所改善，其中脾脏结构损伤情况健脾补肾方小剂量组明显轻于模型组，胸腺肽组、健脾补肾方大剂量组较模型组稍有改善；炎性细胞浸润情况健脾补肾方小剂量组、胸腺肽组较模型组明显减轻，健脾补肾方大剂量组改善不明显。见图1。

图1 正常组和辐射损伤各组小鼠不同时间脾脏组织HE染色表现(×200)

3 讨 论

辐射损伤属于中医中的“攻法”，易损伤人体正气，造成脏腑气血亏虚，日久不复，致脾肾气血亏虚，故辐射损伤属中医的“虚劳”“血虚证”范畴[13]。健脾补肾方以大剂量熟地黄、甘草为君药，熟地黄入肝、肾经，可滋阴养血，填精益髓，补先天肾元；甘草补益脾气，益气复脉，补后天脾胃元气。以黄芪补气健脾、益卫固表，当归补血活血，二者共为臣药，加强益气生血之功效。佐以陈皮理气健脾，以补后天之本，同时行气导滞，以防补益药之滋腻及滞气之弊。以泽泻为使药，宣泄肾浊，引药归经。全方补治脾肾先后天之本，升提阳气，使精气血生化有源。现代药理学研究表明，甘草能够有效刺激T淋巴细胞增殖，增强肥胖小鼠的免疫活性和抗氧化酶的活性[14]。地黄多糖能够提高机体内源性抗氧化功能，促进造血干细胞增殖，升高外周血细胞及免疫器官指数，提高小鼠脾脏CD4+/CD8+T细胞的比值，从而促进辐射所致的骨髓抑制小鼠造血功能的恢复，并增强其免疫功能[15-16]。黄芪多糖可促进造血细胞因子的分泌，改善化疗和放疗引起的骨髓抑制状态[17]，促进Th1型免疫细胞因子表达以及提高B淋巴细胞产生抗体的能力，通过增强细胞免疫及体液免疫，从而改善免疫功能[18]。综上，健脾补肾方具有促进造血细胞增殖和调节免疫功能的双重作用。

外周血细胞是衡量造血功能的重要指标，其中白细胞计数、淋巴细胞计数下降会减弱机体的防御能力，容易使机体继发各种严重感染；血红蛋白含量及红细胞计数下降会导致严重贫血；血小板计数下降可引起不同程度的出血。上述指标的变化均是造成辐射后死亡的重要原因[19]。本实验采用6.0 Gy X射线一次性全身照射后，小鼠外周血各类血细胞计数均显著减少，其中淋巴细胞计数、白细胞计数在照射后第7天急剧下降，且下降趋势最为显著，后期自然恢复缓慢，可能与淋巴细胞具有更高辐射敏感性，或是辐射同时造成白细胞、淋巴细胞再生的免疫器官损伤有关；红细胞计数、血红蛋白含量明显下降，但损伤程度不如白细胞、淋巴细胞严重，且后期恢复较快，可能与成熟红细胞辐射敏感性较低、寿命较长有关；血小板计数在照射后下降很缓慢，主要原因是成熟的巨核细胞辐射敏感性低，在照射后初期也仍可继续生产血小板，但至照射后第14天血小板显著降低，可能与骨髓巨核细胞损伤程度逐步加重，数量逐渐减少，血小板无来源补充有关。与模型组比较，健脾补肾方小、大剂量组白细胞计数、淋巴细胞计数、血红蛋白含量、红细胞计数、血小板计数均明显升高，且健脾补肾方小剂量组于第7天红细胞计数、血红蛋白含量恢复正常，于第14天血小板计数恢复正常，于第30天白细胞计数、淋巴细胞计数恢复正常。说明健脾补肾方可以加快辐射后外周血细胞的恢复，从而降低感染风险，预防贫血和出血的发生。

胸腺、脾脏是机体重要的免疫器官，是免疫细胞发生、分化、发育和成熟的场所，对于维持机体免疫功能起着重要作用，其脏器系数可在一定程度上反映机体免疫功能的强弱[20]。研究表明，当机体遭受大于4.0 Gy照射时，可造成严重的骨髓型放射病[21]。本研究辐射的剂量是6.0 Gy，虽未造成小鼠死亡，但小鼠胸腺指数、脾脏指数以及脾脏组织结构损伤至照射后第30天仍自行缓解不明显，说明辐射已造成小鼠免疫器官的严重损伤，可能与辐射剂量较高，导致骨髓损伤造成干细胞来源不足，免疫器官再生修复能力下降有关。照射后第7天、第14天、第30天，健脾补肾方小、大剂量组胸腺指数、脾脏指数均明显高于模型组，脾脏组织结构损伤明显减轻，且健脾补肾方小剂量组于照射后第14天脾脏指数恢复至正常。说明健脾补肾方可以减轻辐射对免疫器官的损伤，促进免疫器官的修复，从而提高机体防御力和免疫力。

综上所述，健脾补肾方对辐射导致的全血细胞减少及免疫器官损伤具有显著的防护作用。健脾补肾方小剂量组各个指标的改善程度优于健脾补肾方大剂量组，可能由于健脾补肾方中含有熟地黄、甘草、当归等滋腻之品，适宜浓度可益气生血，剂量过大易阻碍脾胃的运化，影响药物的有效吸收，其具体机制有待进一步研究。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。