消渴健脾胶囊质量标准研究*

2022-02-17丁然然朱晓东张丽娟库德热提阿吉杨明霞

中国药业 2022年3期

丁然然，朱晓东，张丽娟，库德热提·阿吉，赵媛，杨明霞△

（1.新疆医科大学，新疆乌鲁木齐830000；2.新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市中医医院，新疆乌鲁木齐 830000）

消渴健脾胶囊是新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市中医医院院内制剂，临床疗效确切［1−2］，由苍术、白术、栀子等13味中药材组方，具有燥湿健脾、行气和胃、祛浊化郁功效，常用于脾虚湿盛型2型糖尿病的治疗［3］，主要用于糖尿病及其并发症的治疗［4］，特别适用于西北地区的人群体质、气候因素及生活饮食习惯。但原质量标准中药味鉴别项较少，且无含量测定项，已不适用制剂的质量控制［5］。栀子具有明显的降糖活性，有效成分栀子苷是其发挥降糖活性的主要成分［6−7］，且含量较高，性质稳定。本研究中以栀子苷为定量评价指标，建立了消渴健脾胶囊的质量标准，为提高其质量和保证临床疗效提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260型色谱仪（美国安捷伦科技有限公司）；KQ−500DE型超声仪（江苏昆山超声仪有限公司，功率为300 W，频率为50 kHz）；WP−UP−IV−10 Water Purifier型超纯水机（四川沃特尔科技有限公司）；硅胶G薄层板（青岛海洋化工厂）；BX50−32H01型生物显微镜（日本奥林巴斯公司）。

1.2 试药

落新妇苷对照品（上海中药标准化研究中心，批号为30−2017，纯度为98%）；栀子苷对照品（批号为120986−201610，纯度为98.8%），栀子对照药材（批号为120986−201510），大黄酚对照品（批号为110758−201507，纯度为98.5%），大黄对照药材（批号为120902−201311），茯苓对照药材（批号为121117−201608），芥子碱硫氰酸盐对照品（批号为111702−201605，纯度为98.3%），莱菔子对照药材（批号为121074−201402），葛根对照药材（批号为121551−201103），葛根素对照品（批号为110752−201813，纯度为98%），均购自中国食品药品检定研究院；消渴健脾胶囊（新疆华世丹药业股份有限公司，批号分别为190102，190103，190104，180422，180423，180424，180425，180426，180427，180428）；乙腈（色谱纯，美国Fisher公司）；其余试剂均为分析纯，购自天津致远化学试剂有限公司。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱（TLC）鉴别

土茯苓：取本品内容物3 g，置25 mL具塞锥形瓶中，加甲醇15 mL，超声（功率为300 W，频率为50 kHz）处理40 min，过滤，取滤液作为供试品溶液。取除土茯苓以外的其他药材，按处方工艺和供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。取落新妇苷对照品，加甲醇制成质量浓度为1 mg/mL的对照品溶液。按2015年版《中国药典（一部）》通则0502 TLC法［8］19，吸取对照品溶液5 µL，供试品溶液和阴性对照品溶液各10 µL，依次点样，以甲苯−乙酸乙酯−甲酸（13∶32∶9，V/V/V）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以新配制的三氯化铝试液，5 min后置紫外光灯（365 nm）下检视。结果供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置显相同颜色的荧光斑点，且阴性对照无干扰。详见图1 A。

栀子：取本品内容物5 g，置100 mL具塞锥形瓶中，加甲醇50 mL，加热回流40 min，滤过，滤液蒸干，加水20 mL溶解残渣，再用饱和的正丁醇溶液提取2次，每次20 mL，合并正丁醇液，蒸干，加5 mL甲醇溶解残留物，即得供试品溶液。取栀子对照药材，按供试品溶液制备方法制备栀子对照药材溶液。取除栀子以外的其他药材，按处方和供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。取栀子苷对照品，加乙醇制成质量浓度为4 mg/mL的对照品溶液。按按2015年版《中国药典（一部）》通则0502 TLC法［8］284，取对照品溶液、对照药材溶液各3µL，供试品溶液、阴性对照品溶液各6 µL，依次点样，以乙酸乙酯−甲酸−冰醋酸−水（10∶0.5∶0.5∶1，V/V/V/V）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2%香草醛硫酸溶液，晾干至斑点显色清晰。结果供试品溶液色谱中，在与对照品溶液、对照药材溶液色谱对应位置显相同颜色的斑点，且阴性对照无干扰。详见图1 B。

大黄：取本品内容物7 g，置50 mL具塞锥形瓶中，加甲醇30 mL，超声（功率为300 W，频率为50 kHz）处理30 min，滤过，取5 mL，滤液水浴蒸干，加10 mL水、1 mL盐酸溶液溶解残留物，加热回流30 min后放至室温，加20 mL乙醚提取2次，合并2次提取液，水浴蒸干，加2 mL三氯甲烷溶解残留物，即得供试品溶液。取大黄对照药材，按供试品溶液制备方法制备对照药材溶液。取除大黄以外的其他药材，按处方工艺和供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。取大黄酚对照品，加甲醇制成质量浓度为1 mg/mL的对照品溶液。按按2015年版《中国药典（一部）》通则0502 TLC法［8］24，取对照药材溶液、对照品溶液各4µL，供试品溶液、阴性对照品溶液各6µL，依次点样，用石油醚（30～60℃）−甲酸乙酯−甲酸（15∶5∶1，V/V/V）上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。结果供试品溶液色谱中，在与对照品溶液、对照药材溶液色谱相应位置显相同颜色的荧光斑点，且阴性对照无干扰。详见图1 C。

1.对照品溶液2.对照药材溶液3−5.供试品溶液6.阴性对照品溶液A.土茯苓（365 nm）B.栀子（日光）C.大黄（365 nm）D.茯苓（365 nm）E.莱菔子（365 nm）F.葛根（365 nm）图1薄层色谱图1.Reference solution 2.Reference medicinal material solution 3−5.Test solution 6.Negative reference solutionA.Smilacis Glabrae Rhizoma（365 nm）B.Gardeniae Fructus（sunlight）C.Rhei Radix et Rhizoma（365 nm）D.Poria（365 nm）E.Raphani Semen（365 nm）F.Puerariae Lobatae Radix（365 nm）Fig.1 TLC chromatograms

茯苓：取本品内容物3 g，置100 mL具塞锥形瓶中，加70%乙醇50 mL，超声处理（功率为300 W，频率为50 kHz）10 min，滤过，滤液蒸干，加2 mL甲醇溶解残留物，即得供试品溶液。取茯苓对照药材，按供试品溶液制备方法制备茯苓对照药材溶液。取除茯苓以外的其他药材，按处方工艺和供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。按按2015年版《中国药典（一部）》通则0502 TLC法［8］251，取对照药材溶液5 µL，供试品溶液、阴性对照品溶液各10 µL，依次点样，以甲苯−乙酸乙酯−甲酸（20∶5∶0.5，V/V/V）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。结果供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相对应位置显相同颜色的荧光斑点，阴性对照无干扰。详见图1 D。

莱菔子：取本品内容物3 g，置100 mL具塞锥形瓶中，加乙醚60 mL，加热回流60 min，挥去乙醚，加20 mL甲醇溶液，加热回流60 min，滤过，蒸干，加2 mL甲醇溶解残渣，即得供试品溶液。取莱菔子对照药材，按供试品溶液制备方法制备对照药材溶液。取除莱菔子以外的其他药材，按处方工艺和供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。取芥子碱硫氰酸盐对照品，加甲醇制成质量浓度为1 mg/mL的对照品。按按2015年版《中国药典（一部）》通则0502 TLC法［8］284，取对照品溶液、对照药材溶液各5 µL，供试品、阴性对照品溶液各10 µL，依次点样，以乙酸乙酯−甲酸−水（10∶2∶3，V/V/V）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。结果供试品溶液色谱中，在与对照品溶液、对照药材溶液色谱相应位置显相同颜色的荧光斑点，且阴性对照无干扰。详见图1 E。

葛根：取本品内容物3 g，加甲醇25 mL，超声（功率为300 W，频率为50 kHz）处理20 min，滤过，蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，即得供试品溶液。取葛根对照药材，按供试品溶液制备方法制备对照药材溶液。取除葛根以外的其他药材，按处方工艺和供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。取葛根素对照品，加甲醇制成质量浓度为1 mg/mL的对照品溶液。按2015年版《中国药典（一部）》通则0502 TLC法［8］347，取对照品溶液、对照药材溶液各5µL，供试品溶液、阴性对照品溶液各10µL，依次点样，以二氯甲烷−甲醇−水（7∶2.5∶0.25，V/V/V）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。结果供试品溶液色谱中，在与对照品溶液、对照药材溶液色谱相应位置显相同颜色的荧光斑点，且阴性对照无干扰。详见图1 F。

2.2 显微鉴别

取胶囊内容物适量，研成粉末，经水合氯醛透化，加稀甘油1滴、间苯三酚1滴，几分钟后加浓硫酸1滴，经显微鉴别其特征性结构。可见，药物粉末纤维木化，呈长梭形，黄色，多成束（白术），草酸钙方晶（葛根），草酸钙簇晶（大黄），不规则颗粒状团块（茯苓），种皮内表皮细胞类长方形（车前子）。详见图2。

2.3 栀子苷含量测定

2.3.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Cosmosil C18柱（250 mm×4.6 mm，5µm）；流动相：乙腈−水（9∶91，V/V）；流速：1 mL/min；柱温：35℃；检测波长：238 nm；进样量：10µL。理论板数按栀子苷峰计应不低于2 000。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相同保留时间处有相应色谱峰出现，且阴性对照无干扰。色谱图见图3。

1.栀子苷A.对照品溶液B.供试品溶液C.阴性对照品溶液图3系统适用性试验高效液相色谱图1.GeniposideA.Reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.3 HPLC chromatograms of the system suitability test

A.白术B.葛根C.大黄D.茯苓E.车前子图2显微鉴别特征（×100）A.Atractylodis Macrocephalae Rhizoma B.Puerariae Lobatae Radix C.Rhei Radix et Rhizoma D.Poria E.Plantaginis SemenFig.2 Microscopic identification characteristics（×100）

2.3.2 溶液制备

取对照品8.652 mg，精密称定，置10 mL容量瓶中，加甲醇定容，制成栀子苷质量浓度为0.865 2 mg/mL的对照品贮备液；取2.5 mL置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，即得质量浓度为0.216 3 mg/mL的对照品溶液。取胶囊内容物，研成粉末，取粉末0.5 g，精密称定，置50 mL容量瓶中，加甲醇适量，超声处理15 min，冷却，加甲醇稀释并定容，混匀，吸取上层澄清溶液，用微孔滤膜（0.45µm）滤过，取续滤液，即得供试品溶液。按处方工艺取缺栀子药材的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2.3.3 方法学考察

线性关系考察：精密量取质量浓度为0.865 2 mg/mL的对照品溶液5 mL，置25 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，得栀子苷质量浓度为173.04µg/mL的溶液。分别精密吸取对照品溶液0.5，1.0，2.0，4.0，5.0 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，充分混匀。分别精密量取上述溶液10µL，按2.3.1项下色谱条件进样分析。以质量浓度（X，µg/mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y=14.125X+7.112 6（r=0.999 6，n=5）。结果表明，栀子苷质量浓度在8.652～173.040µg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：取栀子苷对照品溶液，按2.3.1项下色谱条件进样分析6次。结果峰面积的RSD小于0.66%（n=6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取同一批（批号为190102）样品，研细，取0.5 g，精密称定，共6份，依法制备供试品溶液，按2.3.1项下色谱条件进样分析，计算栀子苷的含量。结果栀子苷的平均质量浓度为1.69 mg/g，RSD小于2.13%（n=6），表明方法重复性良好。

稳定性试验：取同一批（批号为190102）样品，依法制备供试品溶液，按2.3.1项下色谱条件分别于0，3，6，12，18，24 h时进样分析，记录峰面积。结果峰面积的RSD为1.34%（n=6），表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

加样回收试验：采用标准加入法，取重复性试验项下样品粉末0.25 g（栀子苷含量为3.289 mg/g），精密称定，共6份。按样品含量的100%加入栀子苷对照品溶液，依法制备供试品溶液，按2.3.1项下色谱条件进样测定，计算回收率。结果见表1。

表1 栀子苷加样回收试验结果（n=6）Tab.1 Results of the recovery rate of geniposide（n=6）

2.3.4 样品含量测定

取10批样品，依法制备供试品溶液，按2.3.1项下色谱条件平行检测3次，各批样品中栀子苷平均含量为3.292 mg/g。结果见表2。制剂中指标性成分的含量按80%设限［9］，初步拟订消渴健脾胶囊中栀子苷的平均含量不得少于2.633 mg/g，各批样品含量均符合要求。

表2 样品含量测定结果（mg/g，n=3）Tab.2 Results of the content determination of geniposide in the samples（mg/g，n=3）

3 讨论

3.1 TLC鉴别条件选择

本研究中对消渴健脾胶囊中大黄、莱菔子等6味药材进行了鉴别，所建立的TLC方法显色清楚，分离良好，专属性较强，无明显拖尾，阴性对照无干扰，能快速实现对各药材的鉴别。土茯苓、莱菔子的鉴定采用了2015年版《国家药典（一部）》收录的方法。栀子的鉴别参考文献［10−11］，以甲醇作溶剂，栀子苷的提取率较高；以乙酸乙酯−甲酸−乙酸−纯水（10∶0.5∶0.5∶1，V/V/V/V）为展开剂展开，比移值适中且分离度良好。茯苓鉴别参考文献［12］，以75%乙醇处理样品，杂质较少，可排除干扰因素，调整展开条件［13］为石油醚（60～90℃）−乙醚（1∶1，V/V），分离效果较好。大黄的鉴别以大黄酚为对照品，结果供试品溶液、对照品溶液斑点清晰，指标性成分分离良好。葛根展开条件、显色条件参考文献［14−15］，将展开剂三氯甲烷−甲醇−水更改为二氯甲烷，并更改各相比例。因三氯甲烷属危险化学品，具有致癌可能，综合考虑后选择二氯甲烷−甲醇−水作为展开剂。

3.2 色谱条件和提取条件选择

消渴健脾胶囊成分复杂，干扰多。故考察了不同流动相［甲醇−0.2%磷酸水溶液［16］、甲醇−水（30∶70，V/V）［17］、乙腈−水（13∶87，V/V）［18］和乙腈−水（9∶91，V/V）］的洗脱状况，考察指标定为色谱峰的峰形和分离度。采用乙腈−水（9∶91，V/V）流动相洗脱时，栀子苷色谱峰分离度大于1.5，对称性良好，故流动相选用此系统。分别考察了超声波处理和加热冷凝回流处理样品，发现超声处理操作简便，栀子苷的提取率更高，故选择超声处理。