宫颈和食管鳞状细胞癌组织中DNA甲基化谱分析及肿瘤标志物初步筛选

徐丽秀,李金秋,马俊旗,阿仙姑·哈斯木(新疆医科大学基础医学院病理学教研室,乌鲁木齐 8600;新疆医科大学全科医学学院,第七临床学院;新疆医科大学第一附属医院妇科;通讯作者,E-mail:axiangu75@6.com)

tumor markers; common differential genes

鳞状细胞癌是一类起源于上皮组织的肿瘤,根据部位不同分为头颈部鳞状细胞癌(HNSC)、食管鳞状细胞癌(ESCC)、肺鳞状细胞癌(LUSC)和宫颈鳞状细胞癌(CSCC)等,虽其具有共同的组织病理学特征,但病理机制尚不明确。DNA甲基化改变在肿瘤发生过程中发挥了重要作用[1,2],不同类型鳞状细胞癌的发生也被证实与DNA的异常甲基化有关[3],在宫颈鳞状细胞癌、食管鳞状细胞癌以及头颈部鳞状细胞癌中,异常甲基化基因的表达往往与肿瘤的分化程度、TNM分期以及患者的预后不良有关[4-6],且随着研究的深入,部分异常甲基化基因已开始作为不同类型鳞状细胞癌的早期诊断标志物[7,8]。然而,目前对鳞状细胞癌发生过程中共有甲基化基因的研究较少,这些共有甲基化基因可能影响癌细胞的信号转导,进而导致肿瘤发生。本次研究中,采用全基因组DNA甲基化分析,以宫颈鳞状细胞癌和食管鳞状细胞癌为研究对象,找到两种肿瘤中共有差异甲基化基因,为进一步了解鳞状细胞癌的表观遗传机制提供了一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 研究对象

本研究中涉及的32例样本分别取自2012年6月至2013年3月期间,就诊于新疆医科大学第一附属医院妇科和胸外科住院患者。包括8对宫颈鳞状细胞癌组织及其癌旁3 cm正常上皮组织,8对食管鳞状细胞癌组织及其癌旁3 cm正常上皮组织,收集的组织在30 min内存放至-80 ℃保存。每个标本组织均由两名经验丰富的病理医师进行组织病理学诊断。本研究已得到了新疆医科大学第一附属医院伦理委员会的批准(批准文号:20130216-147)。

1.2 DNA制备与亚硫酸氢盐修饰

使用DNA提取试剂盒(QIAGEN, Valencia, CA, USA)从32例组织中提取总DNA。DNA纯度测定通过测量A260/A280,以A260/A280范围在1.80～2.0之间的DNA为实验样本。根据EZ DNA甲基化试剂盒(Zymo Research, Orange, CA, USA)说明书,按照1 μg DNA进行亚硫酸氢盐处理分析。

1.3 Infinium HumanMethylation450 BeadChip(甲基化450k芯片)分析

采用Infinium Human-Methylation 450k Bead Chip(Illumina, Inc., San Diego, CA, USA)进行DNA甲基化分析。根据Illumina公司操作说明进行,步骤如下:将经过亚硫酸盐处理后的DNA经过15 μl洗脱缓冲液洗脱后用异丙醇重悬DNA,于Infinium HumanMethylation450 Bead Chips中杂交过夜。经过杂交后,将游离DNA去除,通过单核苷酸扩增处理BeadChips,使用Illumina iScan仪器对BeadChips样本进行扫描以获得原始数据。

1.4 生物信息学分析

利用在线软件KEGG pathways分析(www.genome.jp/kegg/pathway.html)对DNA甲基化基因进行通路富集分析。使用在线软件GO分析(http://bioinfo.capitalbio.com/mas3/)对富集途径中的基因功能进行分析,包括生物过程、细胞组分和分子功能。对获得的差异基因通过UALCAN在线数据库(http://ualcan.path.uab.edu)和GEPIA在线数据库(http://gepia.cancer-pku.cn/)进行验证。

1.5 统计学分析

1.5.1 宫颈鳞状细胞癌与食管鳞状细胞癌基因甲基化芯片的原始数据处理 采用GenomeStudio v1.9软件对经过Illumina处理后32例样本的原始数据进行整理分析,在配对的癌与癌旁组织中每个基因的表达中位数之比为差异倍数(fold change),进行配对t检验,得到相应P值。去除掉P>0.05的样本及探针集后,使用Lumi和R包对原始数据进行归一化处理。Lumi将得到的归一化数据中单个CpG位点转化为甲基化值,即β值,β值范围为0～1,分别对应完全未甲基化位点和完全甲基化位点。随后,利用R包的limma模态分析不同样品之间的差异,CpG位点筛选标准为|Δβ|>0.2,P<0.05,符合以上条件被认为可以作为差异甲基化基因。

2 结果

2.1 鳞状细胞癌中甲基化谱差异分析

采用全基因组DNA甲基化分析,分别对宫颈鳞状细胞癌、食管鳞状细胞癌及其癌旁正常组织进行检测,根据|Δβ|>0.2,P<0.05,8例宫颈鳞状细胞癌组织中共筛选出29 505个差异甲基化位点,其中9 227个高甲基化差异位点,20 278个低甲基化差异位点;8例食管鳞状细胞癌组织中共筛选出54 009个差异位点,包括21 515个高甲基化位点,32 494个低甲基化位点,两种组织共有差异位点5 421个,其中2 869个高甲基化位点,2 552个低甲基化位点(见表1)。

表1 宫颈鳞状细胞癌和食管鳞状细胞癌组织与癌旁组织中差异甲基化CpG位点

2.2 鳞状细胞癌组织中差异甲基化位点区域分布情况

对差异位点的亚定位区域分析发现,宫颈鳞状细胞癌和食管鳞状细胞癌组织中超过50%的差异位点位于CpG岛相关区域以外的区域(open sea),但两种组织的共有差异位点主要分布于CpG岛(见表2)。在基因结构分析中,宫颈鳞状细胞癌和食管鳞状细胞癌组织中差异甲基化位点分布区域主要位于gene body,其次为TSS1500,5′UTR,TSS200,而共有差异甲基化位点主要分布于gene body和5′UTR区域(见表3)。

表2 宫颈癌和食管癌组织与癌旁组织差异甲基化中CpG位点分布情况 个(%)

表3 宫颈鳞状细胞癌和食管鳞状细胞癌组织与癌旁组织中差异甲基化CpG位点在基因功能区域的分布 个(%)

2.3 鳞状细胞癌中差异甲基化基因的鉴定

根据差异甲基化位点进一步匹配得到相应的差异基因,宫颈鳞状细胞癌组织筛选得到13 790个差异基因,食管鳞状细胞癌组织得到15 207个差异基因,共有差异基因2 041个(见图1)。

2.4 GO富集分析及KEGG富集分析结果

对得到的2 041个差异基因进行富集分析,GO分析结果提示,在生物进程功能注释类别中,这些基因主要富集于信号传导、细胞黏附、胚胎骨骼系统形态发生;在分子功能注释类别中,主要集中于基因序列特异性结合、基因序列特异性结合转录因子活性、钙通道活性的调节;在细胞组分注释类别中,主要以质膜、基底膜、质膜的整体组成为中心(见图2)。KEGG-pathway分析结果表明,差异甲基化基因主要富集于25条信号通路,主要涉及黏着斑(hsa04510)、癌症信号通路(hsa05200)、细胞外基质受体相互作用(hsa04512)和肌动蛋白细胞骨架调节(hsa04810),前10条通路见表4。

CSCC1～4分别为4例宫颈鳞状细胞癌样本;ESCC1～4分别为4例食管鳞状细胞癌样本;Cervical tissue 1～4分别为4例宫颈鳞状细胞癌癌旁样本;Esophageal tissue 1～4分别为4例食管鳞状细胞癌癌旁样本图1 宫颈鳞状细胞癌/食管鳞状细胞癌肿瘤组织组与癌旁组织组差异甲基化基因热图Figure 1 Heatmap of differentially methylated genes between tumor tissues and adjacent normal tissues

图2 宫颈鳞状细胞癌与食管鳞状细胞癌中共有差异甲基化基因的GO分析Figure 2 GO analysis of common differential methylated genes in CSCC and ESCC

2.5 差异基因标志物筛选结果

从25条通路中选取富集最显著的10条通路,其中,7条通路中均出现ITGA6。利用UALCAN数据库和GEPIA数据库对ITGA6基因进行验证,UALCAN结果提示,在宫颈宫颈鳞状细胞癌癌和食管鳞状细胞癌中,ITGA6的表达高于正常组织,差异具有统计学意义(P<0.05,见图3A)。GEPIA数据库结果显示,在食管鳞状细胞癌ITGA6基因的表达高于正常组织,差异具有统计学意义(P<0.05),但在宫颈鳞状细胞癌中未出现显著差异(见图3B)。

表4 宫颈鳞状细胞癌与食管鳞状细胞癌中共有差异甲基化基因的KEGG富集分析结果

CSEC:宫颈鳞状上皮细胞癌;ESCA:食管鳞状上皮细胞癌;与相应正常组织比较,*P<0.05图3 UALCAN数据库和GEPIA数据库中ITGA6在宫颈鳞状细胞癌及食管鳞状细胞癌中的表达Figure 3 The expression of ITGA6 in CSEC/ESCA and normal tissues on UALCAN database and GEPIA database

3 讨论

世界范围内,宫颈癌作为女性第四大恶性肿瘤,威胁全球女性的健康[9];食管癌作为四大肿瘤之一,同样给人类带来巨大的公共健康问题[10]。在新疆地区,食管癌和宫颈癌作为此地区主要肿瘤类型[11],尽管医疗诊断及治疗的水平有了很大程度的改善,然而这两种肿瘤的患病率及死亡率仍然居高不下。因此,能够有效地对疾病做出早期诊断,提高患者生活质量,是亟待解决的问题。宫颈鳞状细胞癌和食管鳞状细胞癌均是鳞状上皮细胞来源的肿瘤,其具有共同的组织病理学类型,寻找一种共有的分子生物学标志物将有助于鳞状细胞癌的早期诊断,从而提高患者的预后。

表观遗传学已证实在肿瘤的发生过程中扮演着重要的角色,其中,DNA甲基化作为主要的表观遗传机制,为研究肿瘤早期发现提供了有力的理论依据。通常认为正常细胞中往往呈现低甲基化,抑癌基因的高甲基化或者癌基因的低甲基化是导致肿瘤发生的开端。目前,在抗肿瘤治疗中,已有部分甲基转移酶抑制剂获得FDA批准,这预示着甲基化研究在肿瘤治疗领域中拥有广阔的应用前景[12]。然而,针对鳞状细胞癌中共有的甲基化基因的研究却鲜有报道。在本次研究中,选取鳞状细胞癌中的两种类型(宫颈鳞状细胞癌和食管鳞状细胞癌)找到其与癌旁正常组织间的差异甲基化基因,进一步筛选得到两种组织的共有差异基因,为鳞状细胞癌的诊断、患者预后的评估和临床治疗的选择提供依据。

研究证实DNA异常甲基化通常发生于CpG位点,本次研究发现宫颈鳞状细胞癌和食管鳞状细胞癌组织中,低甲基化CpG位点的数量远远高于高甲基化位点数量,提示在肿瘤发生过程中肿瘤的DNA甲基化状态会随之发生明显的改变,其中CpG岛的异常甲基化被认为与肿瘤发生密切相关。CpG岛(CpG island)是指CpG二核苷酸大量富集于基因的5′调控区,在基因表达调控中发挥重要作用的DNA序列。本次研究结果中观察到在宫颈鳞状细胞癌和食管鳞状细胞癌中分别有5 278和5 841个甲基化差异位点位于CpG岛,值得注意的是,在这两种肿瘤组织中差异甲基化位点更频繁地出现在shores,而不是在CpG岛。尽管对这一亚定位的生物学意义了解相对较少,但研究提示疾病的发生与islands, shores和shelves上的甲基化变化存在一定的关系[13]。此外,一项关于人类结肠癌甲基化的研究发现,大多数甲基化改变发生在shores,并不是传统意义上的CpG岛[14]。提示shores上甲基化位点的变化可能与鳞状细胞癌的发生存在一定联系。CpG岛上的基因启动子区域(TSS1500、TSS200、5′UTR和第1外显子)发生甲基化改变可以直接调控基因的异常表达,包括癌基因的激活以及抑癌基因的失活[15],既往研究报道,HEADLAMP技术根据宫颈癌中DAPK1启动子高甲基化的特征可以高效率检测宫颈癌病变[16]。Kadian等[17]发现高危HPV感染可以诱导人子宫颈鳞状细胞癌中APC、SFRP1和PTEN基因启动子区域呈现高甲基化状态,促使这些基因的表达沉默,进而触发肿瘤的发生。ZFPs启动子甲基化缺失可以抑制其与下游FZD1和DVL2蛋白结合,阻遏Wnt/β-catenin信号活化,在食管鳞状细胞癌中起到抑癌基因的作用[18]。本次研究发现,启动子区域上分布着大量的差异甲基化位点,提示基因启动子甲基化水平改变可能会潜在地影响宫颈癌和食管癌中多个靶基因的转录活性,进一步诱导肿瘤的发生。

将宫颈癌和食管癌中筛选出的2 041个共有差异甲基化基因通过GO功能富集分析和KEGG通路分析,GO分析结果提示,在生物进程功能注释类别中,这些基因主要富集于信号传导、细胞黏附、胚胎骨骼系统形态发生;在分子功能注释类别中,主要集中于基因序列特异性结合、基因序列特异性结合转录因子活性、钙通道活性的调节;在细胞组分注释类别中,主要以质膜、质膜的整体组成、基底膜为中心。KEGG通路分析结果显示,以上甲基化基因主要富集于25条信号通路,包括黏着斑(hsa04510)、癌症信号通路(hsa05200)、细胞外基质受体相互作用(hsa04512)和肌动蛋白细胞骨架调节(hsa04810)。随后,从25条通路中选取富集最显著的10条通路发现,7条通路中均出现ITGA6基因,利用UALCAN数据库和GEPIA数据库对ITGA6基因进行验证,结果提示,与正常组织相比,ITGA6在癌组织中高表达。ITGA6已证实在前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌中均作为致癌基因,促进肿瘤的恶性进展[19-21]。在宫颈癌中,ITGA6可以与miR-144形成复合体,增强癌细胞的增殖及转移能力[22]。ITGA6可以作为食管癌生存预后的指标[23],且抑制了食管癌组织对放疗抵抗的敏感性[24]。

综上所述,甲基化芯片联合生物信息学分析筛选并初步鉴定ITGA6基因可以作为鳞状细胞癌差异甲基化基因,接下来,需要进行功能性实验来验证ITGA6基因在鳞状细胞癌中的具体作用,为找到鳞状细胞癌的共有分子指标或治疗靶点提供理论依据。