胃癌组织中PTEN、RUNX3基因甲基化与幽门螺杆菌感染的关系

崔国艳，申 俞，李云飞，张慧鹏(长治医学院微生物学教研室，长治 046000；长治医学院第一临床学院；长治医学院附属和济医院普外科)

胃癌是临床上最为常见的一种恶性肿瘤，已成为发生率位居世界第五的癌症，其死亡率高达75%。相关统计数据表明胃癌已成为癌症死亡原因的第三位[1,2]，因为诊断筛查方法不足，大多数胃癌患者(≥50%)仅在晚期诊断出来[3]，因此识别胃癌分子生物标志物有助于该疾病的早期诊断。基因启动子区DNA的异常甲基化可导致肿瘤抑制基因和细胞中其他肿瘤相关基因的失活，是目前胃癌中最明确的表观遗传标记[4]。而特定基因甲基化的变化可作为胃癌进展的预测因子，如抑癌基因PTEN和RUNX3。PTEN是一种具有磷酸酶活性的抑癌基因，位于人类10q23染色体，其在细胞凋亡、细胞增殖和抑制细胞黏附及肿瘤转移的功能中起重要作用[5-7]。在胃癌患者的癌症病灶处，RUNX3的表达缺失或下调，发生机制多为高甲基化、杂合性缺失或点突变等，而RUNX3启动子的高甲基化是造成胃癌中基因失活的主要原因[8,9]。另据国际癌症研究中心(IARC)的报告表明，78%的胃癌与幽门螺杆(H.pylori，Hp)感染相关[10]。

本研究据此在胃癌高发区山西省长治市展开研究，探讨PTEN、RUNX3启动子甲基化与胃癌临床特征之间的关系，明确幽门螺杆菌感染、基因和表观遗传因素三者在胃癌发生发展中的作用，为胃癌的诊断和疗效评估提供理论依据和分子靶标奠定基础。

1 材料与方法

1.1 病例及标本

收集2019年1月至12月在长治医学院附属和济医院行外科手术的胃癌患者为研究对象，女性50例，男性50例，年龄在39～84岁，平均年龄为63.26岁，所有病例术前未进行放化疗治疗，且临床诊断均为胃癌。临床分期按肿瘤浸润深度分期，以国际抗癌联盟(UICC)TNM分期法为标准：胃癌Ⅰ～Ⅱ级33例，胃癌Ⅲ～Ⅵ级67例。淋巴结转移58例，无淋巴结转移42例。肿瘤分化程度低分化48例，高中分化52例。以上标本均经病理组织学检查证实，术后取其切除的胃癌组织100份，取其对应的癌旁组织(距癌组织边缘>5 cm的正常胃黏膜组织)为对照组，所有标本于-70 ℃冰箱冻存。所有标本均在与患者沟通并征得其同意的情况下收集，符合医院医学伦理委员会的要求。

1.2 H. pylori检测

100例胃癌组患者(近2周内均未服用过抗生素、铋剂、质子泵抑制剂等)，检查前均行13C尿素呼气试验。通过口服13C尿素胶囊进入胃部，如果Hp存在，其分解尿素酶进而水解尿素，尿素进一步被水解形成CO2从肺部以气体呼出，检测专用的呼气卡中是否有13C，如果有则表示Hp阳性。诊断标准:超基准值(delta over baseline，DOB)>4为Hp阳性，DOB值<4为Hp阴性。

1.3 基因启动子甲基化水平检测

1.3.1 基因组DNA的提取 按照QIAGEN公司提供的基因组提取试剂盒说明书严格提取DNA,由Thermo SCIENTIFIC公司提供的Nano Drop2000C检测DNA含量及纯度，琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，置于-20 ℃保存备用。

1.3.2 DNA甲基化修饰及纯化 参照QIAGEN公司提供的EpiTect Fast DNA Bisulfite Kit进行亚硫酸氢盐修饰，DNA纯化试剂盒(碧云天公司)纯化回收DNA，-20 ℃保存备用。

1.3.3 甲基化特异性PCR扩增(methylation specific PCR，MSP) 利用ethprimer软件设计引物，PTEN特异性甲基化引物(PTEN-M)，正向引物：5′-GTATTTCGAGTAAAGGAAGAAGACG-3′，反向引物：5′-GATAAAAAACTACAACCCAACGAA-3′，PTEN特异性非甲基化引物(PTEN-U)正向引物：5′-TATTTTGAGTAAAGGAAGAAGATGA-3′，反向引物：5′-CAATAAAAAACTACAACCCAACAAA-3′；RUNX3特异性甲基化引物(RUNX3-M)，正向引物：5′-GTATTTCGAGTAAAGGAAGAAGACG-3′，反向引物：5′-GATAAAAAACTACAACCCAACGAA-3′；RUNX3特异性非甲基化引物(RUNX3-U)，正向引物：5′-GTGTTTTATTGTGGAGTGGGGTT-3′，反向引物：5′-CCAATCAACAAACTCCCAACAA-3′。PCR总反应体系为25 μl，DNA 1 μl，10×Buffer 2.5 μl，dNTP(10 mmol/L)0.5 μl，Q5 high-fidelity DNA polymerase 0.5 μl，正、反向引物各1 μl，5×High GC Buffer 5 μl，ddH2O补齐。PCR反应条件为：94 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min，Tm-5 ℃ 1 min，72 ℃ 1 kb/min，35个循环，72 ℃延伸5 min。4 ℃冷却保存。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳验证,如PTEN-M、RUNX3-M引物扩增出条带，而PTEN-U、RUNX3-U引物未扩增出条带，说明PTEN、RUNX3基因启动子区发生了完全甲基化；如PTEN-M、RUNX3-M引物未扩增出条带，而PTEN-U、RUNX3-U引物扩增出条带，说明PTEN-M、RUNX3-M基因启动子区未发生甲基化；如两种引物均扩增出相应的条带，说明存在部分甲基化；部分甲基化和完全甲基化均判定为甲基化。

1.4 焦磷酸测序

取上述PCR产物送测序公司(上海生工生物工程有限公司)进行测序分析。测序结果分析方法：检测其中连续3个CpG位点甲基化百分率，取值范围为0～100%，用这3个位点甲基化百分率的平均值作为该样本PTEN和RUNX3基因甲基化最终检测值。

1.5 统计学分析

数据采用SPSS19.0统计软件进行分析。计数资料比较采用χ2检验或Fisher精确检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PTEN和RUNX3基因启动子甲基化

在100例癌组织和癌旁组织，PTEN基因总甲基化水平分别为40%和4%；RUNX3基因总甲基化水平分别为64%和8%，且PTEN和RUNX3基因甲基化在癌组织和癌旁组织中差异有统计学意义(P<0.01，见表1)。PTEN启动子区甲基化和非甲基化PCR产物片段分别为200 bp和100 bp(见图1)，RUNX3启动子区甲基化和非甲基化PCR产物片段分别为212 bp和151 bp(见图2)，且在癌组织和癌旁组织中均发现有特异性条带，说明存在部分甲基化。

表1 两组PTEN和RUNX3基因启动子甲基化比较

M：特异性甲基化引物扩增；U：特异性非甲基化引物扩增；P：癌旁组织；C：癌组织；每组C/P代表同一患者的不同组织图1 癌组织和癌旁组织中PTEN基因甲基化状态Figure 1 PTEN gene methylation in gastric cancer tissue and paracancer tissue

M：特异性甲基化引物扩增；U：特异性非甲基化引物扩增；P：癌旁组织；C：癌组织；每组C/P代表同一患者的不同组织图2 癌组织和癌旁组织中RUNX3基因启动子甲基化状态Figure 2 RUNX3 gene methylation in gastric cancer tissue and paracancer tissue

2.2 PTEN和RUNX3基因甲基化与胃癌临床病理特征的关系

PTEN和RUNX3基因甲基化阳性表达与胃癌患者的年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤部位无关(P>0.05)，与淋巴结转移、TNM分期密切相关(P<0.05)；RUNX3基因甲基化与肿瘤分化程度相关(P=0.001)，PTEN基因甲基化与肿瘤分化程度无关(P=0.522，见表2)。

2.3 PTEN和RUNX3基因甲基化与H. pylori感染相关性

在100例胃癌组织中H.pylori感染阳性68例，PTEN基因甲基化38例，甲基化率为55.9%(38/68)，高于H.pylori感染阴性患者的甲基化率31.3%(10/32)，二者差异有统计学意义(P=0.031)；RUNX3基因甲基化32例，甲基化率为47.1%,高于H.pylori感染阴性患者的15.6%，二者差异有统计学意义(P=0.003)。PTEN和RUNX3基因在H.pylori阳性和阴性组织中二者甲基化差异有统计学意义(P<0.05，见表3)。胃癌组织中PTEN和RUNX3基因甲基化在H.pylori阳性组中较阴性组中高，提示H.pylori感染可促进PTEN和RUNX3基因甲基化。

3 讨论

基因启动子区DNA的异常甲基化可导致肿瘤抑制基因和细胞中其他肿瘤相关基因的失活，是目前胃癌中最明确的表观遗传标记[11,12]。Kang等[13]的报道表明，PTEN因甲基化而失活后将导致与肿瘤发生、发展相关的一系列生物学行为的改变,例如细胞增殖与凋亡失调,肿瘤侵袭转移能力增强等,说明PTEN基因甲基化在胃癌的发生发展中起着重要的作用。Kazemi等[14]研究显示，RUNX3启动子区的CpG异常甲基化不但会造成机体内mRNA与蛋白表达的缺失，也会因影响基因的表达造成TGF-β信号通路的紊乱，从而引发胃癌。但以上研究并未区分是否有Hp感染，忽略了Hp在胃癌发生发展中的影响。陈绮丹等[15]研究结果显示，Hp阳性组胃黏膜组织中PTEN mRNA及蛋白表达水平显著降低，提示PTEN可能在Hp感染相关胃癌中发挥作用。李雪等[16]研究得出幽门螺杆菌感染可能诱使RUNX3基因甲基化，从而导致抑癌基因RUNX3失去活性，导致胃癌发生。由此可知抑癌基因RUNX3和PTEN的甲基化与胃癌的发生密切相关。

表2 胃癌组织PTEN、RUNX3甲基化与临床病理特征的关系 (例)

本研究结果显示，在胃癌组织中PTEN和RUNX3基因甲基化阳性率分别为40%和64%，与相应的癌旁组织相比较，基因甲基化阳性率均增加。在胃癌组织中PTEN、RUNX3基因甲基化率与淋巴结转移、TNM分期密切相关(P<0.05),而在不同年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤部位的患者PTEN和RUNX3基因甲基化率比较差异无统计学意义(P>0.05)，提示PTEN和RUNX3基因甲基化情况可用于判断肿瘤的转移情况,预测胃癌手术的放化疗疗效等，与文献报道一致[17]。另外在本研究中，H.pylori感染阳性的胃癌组织中PTEN、RUNX3基因甲基化水平分别为55.9%和47.1%，高于相应的阴性组的31.3%和15.6%，差异均有统计学意义，提示PTEN和RUNX3基因的高表达与幽门螺杆菌感染有关，幽门螺杆菌感染可能通过DNA甲基化抑制PTEN、RUNX3基因表达从而促进胃癌发生发展。

综上所述，胃癌患者的PTEN与RUNX3基因甲基化可抑制抑癌基因的表达，而Hp的感染可促进PTEN和RUNX3基因的甲基化，促进胃癌的发生。另外PTEN和RUNX3基因甲基化检测对胃癌的进展和转移具有临床诊断意义。但因研究过程有限、样本量偏小，对于复杂的肿瘤病因和表观遗传学之间的复杂关系仍待进一步研究。