骐龙血脉健方对ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化及CD36蛋白表达、Ox-LDL水平的影响

封 锐,王丹丹,师 帅,魏娜敏,张安晶,胡元会(中国中医科学院广安门医院南区内一科,北京 100026;通讯作者,E-mail:huiyuhui55@sohu.com)

心血管疾病已成为我国居民健康的头号威胁,其中动脉粥样硬化相关性疾病居于心源性致死疾病的前列[1]。其中,动脉粥样硬化所诱发的冠心病、缺血性脑卒中和外周血管疾病危害极大[2],给社会、患者及其家庭均带来了巨大的经济负担和难以估量的损失。因此,推进动脉粥样防治药物的研发和药理研究,有着积极而深远的意义。

中医典籍中并无动脉粥样硬化的记载,但根据临床实践的观察和总结,动脉粥样硬化性临证特点散布于我国传统医学中“胸痹”“真心痛”“中风”等的症状表现中,与中医“痰、瘀”等病理产物所导致的证候特点高度吻合[3]。骐龙血脉健方为胡元会教授依据多年临床实践创制的方剂,对动脉粥样硬化性疾病的疗效确切[4]。本研究通过复制ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化(AS)模型,探讨骐龙血脉健方对血脂代谢、动脉粥样硬化的调节作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 药材

骐龙血脉健方:由黄连、法半夏、瓜蒌、乳香、没药、绞股蓝等中药颗粒组成,购自四川绿色药业公司。阿托伐他汀钙片(立普妥,20 mg/片×7片/盒,辉瑞制药)。

1.2 动物与饲料

选取SPF级8周龄雄性C57BL/6J小鼠8只、ApoE-/-小鼠40只,购自北京维通利华公司,许可证SCXK(京)2016-0006,于北京广安门医院SPF级实验动物中心进行饲养。以含脂肪21%、胆固醇0.15%的高脂饮食饲料喂养ApoE-/-小鼠;用标准饲料喂养C57BL/6J野生型小鼠。本实验中所有动物饲养及操作均严格遵守国家动物福利伦理及保护规定。

1.3 主要设备与器械

MSE125P-1CE-DU精密电子分析天平(Sartorius,Germany)、低温高速离心机(Sigma,Germany)、IX70显微镜(Olympus,Japan)、AU5822全自动生化仪(Beckman,USA)、Milli-Q mini-sub cell GT电泳槽(BIO-RAD,USA)、Chemi DOC NP凝胶成像系统(BIO-RAD,USA)、Navios多功能酶标仪(雷杜,China)。

1.4 主要试剂

油红O试剂盒(Sigma,USA,MAK194)、Anti-CD36抗体(abcam,England,ab133625)、Ox-LDL ELISA Kit(武汉华美生物,China,CSB-E07933m)。

1.5 实验分组及给药

1.5.1 分组及模型构建 将40只8周龄雄性ApoE-/-小鼠按随机数表法进行随机分组:模型组、阿托伐组、骐龙血脉健方大、中、小剂量组,每组8只,均给予含脂肪21%、胆固醇0.15%的高脂饮食饲料,连续喂养14周,以构建小鼠高脂血症模型。另选取8只8周龄雄性C57BL/6J小鼠作为空白组,给予标准饲料喂养。

1.5.2 给药方式 将颗粒剂骐龙血脉健方研磨后用生理盐水配制成中药混悬液,现用现配,配好后于4 ℃冰箱保存。将阿托伐他汀钙片研磨后用生理盐水配制成阿托伐他汀钙溶液,现用现配,配好后于4 ℃冰箱保存。正常对照组和模型组予生理盐水灌胃,阿托伐他汀钙组给予阿托伐他汀钙溶液灌胃,骐龙血脉健方颗粒剂不同剂量组分别给予大、中、小相应剂量中药混悬液灌胃。具体安排如下:①正常组及模型组按照每天0.1 ml/10 g体质量予小鼠氯化钠注射液(0.009 g/ml);②阿托伐组按照每天0.1 ml/10 g体质量予小鼠阿托伐他汀钙溶液(0.300 3 mg/ml);③骐龙血脉健方大剂量组以临床用量20倍(36.04 g/ml)、中剂量组以临床用量10倍(18.02 g/ml)、小剂量组以临床用量5倍(9.01 g/ml)配置溶液,按照每天0.1 ml/10 g体质量来灌胃。共灌胃14周,每日一次,本实验的用药量根据每周实测体质量进行调整。

1.5.3 取材及处理 所有动物在最后一次灌胃结束空腹12 h后取材。①通过摘眼球方式取血,保存于采血管中,离心(3 000 r/min,4 ℃,10 min)获得血清和血浆,放-80 ℃冰箱长期存储。②采用颈椎脱臼法处死小鼠后,沿腹中线剪开皮肤及薄膜,剪开胸腔去除各个器官,使用注射器将生理盐水从小鼠心尖部刺入左心室进行冲洗。仔细分离开主动脉周围包绕的脂肪组织直至完整暴露,随后将主动脉束小心剥离下来,放于冻存管中,液氮快速冷冻后存入-80 ℃冰箱。

1.6 血脂、Ox-LDL水平及主动脉CD36蛋白表达检测

在喂养14周结束后进行取血,用生化仪检测各组小鼠血清甘油三脂(triglyceride,TG)、血清总胆固醇(total serum cholesterol,TC)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)。ELISA法测定血清氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,Ox-LDL)浓度[5]。Western blot检测小鼠主动脉CD36蛋白表达[6]。

1.7 斑块面积检测

主动脉经油红O染色,检测各组小鼠主动脉内脂质沉积及斑块面积,测量主动脉斑块面积和管腔面积,计算斑块面积与管腔面积之比。主动脉HE染色切片,观察主动脉组织结构的病理变化。

1.8 数据分析

2 结果

2.1 骐龙血脉健方对血脂的影响

14周结束时,与空白组比较,模型组小鼠血清TC、TG、LDL-C水平明显升高(P<0.01,见表1)。与模型组比较,阿托伐组小鼠TC、TG、LDL-C均显著降低(P<0.01),骐龙血脉健方大剂量组TC、TG、LDL-C均显著降低(P<0.01),骐龙血脉健方中剂量组和骐龙血脉健方小剂量组小鼠血清TC显著降低(P<0.01)。与阿托伐组比较,大剂量组TC、LDL-C水平显著降低(P<0.05),而TG水平升高(P<0.05),中、小剂量组TC水平无统计学变化(P>0.05,见表1)。各组间比较HDL-C水平差异没有统计学意义。

表1 各组小鼠血脂水平

2.2 动脉硬化斑块面积/内膜总面积情况

油红O特异性地将组织和细胞内脂质以及脂蛋白等染色,呈红色部位为动脉粥样硬化斑块(见图1)。与空白组相比,模型组小鼠动脉硬化斑块面积与内膜总面积比值显著增加(P<0.05);与模型组比较,阿托伐组和骐龙血脉健方大剂量组动脉硬化斑块面积与内膜总面积比值显著降低(P<0.05);骐龙血脉健大剂量组与阿托伐组动脉硬化斑块面积与内膜总面积比值差异无统计学意义(P>0.05,见图2)。

图1 各组小鼠主动脉粥样硬化情况Figure 1 Aortic atherosclerosis of mice in each group

与空白组相比较,##P<0.01;与模型组相比较,**P<0.01图2 各组小鼠动脉粥样斑块面积/内膜总面积情况比较Figure 2 Comparison of atherosclerotic plaque area/total aortic intima area in mice between groups

2.3 主动脉横截面HE染色

空白组血管平滑肌形态正常,结构完整,排列整齐,各层分界清晰,内皮结构完整,未见炎症及AS斑块形成;模型组血管内膜增厚,管腔内出现AS斑块,血管平滑肌形态异常,结构紊乱,排列散乱,可见散在泡沫细胞和炎症细胞;阿托伐组和骐龙血脉健方大剂量组血管平滑肌形态结构规整,分界清晰,可见少量脱落细胞;骐龙血脉健方中剂量组血管平滑肌形态结构基本正常,管壁可见散在泡沫细胞浸润。骐龙血脉健方小剂量组血管内膜明显增厚,管腔内可见散在AS斑块,血管平滑肌结构紊乱,可见散在泡沫细胞和炎症细胞(见图3)。

2.4 骐龙血脉健方对ApoE-/-小鼠血清Ox-LDL的影响

与空白组相比,模型组的Ox-LDL明显升高(P<0.05)。与模型组相比,骐龙血脉健方大剂量组血清Ox-LDL含量显著下降(P<0.01),阿托伐组和骐龙血脉健方中剂量组血清Ox-LDL含量也明显减少(P<0.05),骐龙血脉健方小剂量组血清Ox-LDL含量无明显变化(P>0.05)。骐龙血脉健大、中剂量组Ox-LDL水平与阿托伐组比较无显著差异(P>0.05),大剂量组与中剂量组Ox-LDL水平无统计学差异(P>0.05,见图4)。

图3 各组小鼠主动脉切片HE染色情况 (×10)Figure 3 HE staining of aortic sections of mice in each group (×10)

与空白组相比较,##P<0.01;与模型组相比较,*P<0.05,**P<0.01图4 各组小鼠血清Ox-LDL含量Figure 4 Serum Ox-LDL content in mice in each group

2.5 对主动脉CD36蛋白表达影响

与空白组相比,模型组主动脉中CD36蛋白表达明显升高(P<0.01)。与模型组相比,阿托伐组的CD36蛋白表达量有所减少(P<0.05),骐龙血脉健方大剂量组CD36蛋白表达量明显减少(P<0.01,见图5)。骐龙血脉健大剂量组主动脉CD36蛋白表达与阿托伐组无统计学差异(P>0.05,见图5)。

3 讨论

随着社会发展和人民生活水平的提高,心脑血管疾病呈现高发趋势[7],而动脉粥样硬化是导致冠心病、脑卒中等心脑血管疾病的元凶,是多种心脑血管疾病的危险因素和病理基础。中医典籍中无动脉粥样硬化的论述,根据临床疾病的证候特点,其散布于“胸痹、真心痛、中风”等疾病的范畴,其病机的要点主要为“痰、瘀、虚”等。其中痰瘀互结证在诸多证候中占据最大的比重[8],是心脑血管疾病的主要证素[3]。

骐龙血脉健方是胡元会教授多年临床经验总结,是治疗以痰瘀互结型高血压、冠心病及脑血管疾病的常用方剂。其中黄连、半夏、瓜蒌为伤寒论经典名方小陷胸汤,乳香、没药、血竭为活血化瘀之品,绞股蓝、茯苓益气健脾杜绝生痰之源。研究证实,黄连能够降低心肌耗氧量、改善心肌缺血,半夏能够治疗心律失常,瓜蒌能够降脂、化痰,三药合用起到涤痰活血、抗动脉粥样硬化的作用[9]。乳香、没药、血竭能够抗血小板活化[10]、改善血液流变学[11]。而绞股蓝降脂、抗氧化的作用早已被国内外研究证实[12,13]。茯苓健脾利湿、宁心安神的作用能够有效改善AS患者心悸失眠等症状。

与空白组相比较,##P<0.01;与模型组相比较,*P<0.05,**P<0.01图5 各组小鼠主动脉CD36蛋白表达Figure 5 The expression of CD36 protein in the aorta of mice in each group

动脉粥样硬化的病理机制有多种,其中Ox-LDL是最重要的致动脉硬化因子,它通过介导内皮损伤和参与泡沫细胞的形成来加速动脉粥样硬化的发展进程[14]。CD36广泛表达于单核细胞、巨噬细胞、微血管内皮细胞、平滑肌细胞、血小板等多种细胞表面,可与多种配体结合,介导先天性免疫、血栓形成、炎症和动脉粥样硬化等不同的生物过程。作为B族清道夫受体(SR-B)中的主要亚型之一,CD36能够无限制地摄取Ox-LDL[15,16],加速泡沫细胞形成及脂质沉积,形成最早的动脉粥样病变。而巨噬细胞通过CD36摄取Ox-LDL,并激活过氧化物酶体增殖物激活型受体γ(PPARγ)在转录水平上活化PPARγ,从而形成一个正反馈增加CD36的表达,诱导泡沫细胞形成并释放促炎细胞因子、活性氧(ROS)和金属蛋白酶,扩大炎症反应[17]。

本研究结果显示,骐龙血脉健方能够有效降低ApoE-/-小鼠主动脉粥样硬化斑块面积,改善TC、TG、LDL-C水平。与模型组相比,阿托伐组与骐龙血脉健方大剂量组ApoE-/-小鼠主动脉粥样硬化斑块面积显著降低(P<0.05);与阿托伐组相比,骐龙血脉健大剂量组斑块面积与内膜总面积比值无明显变化(P>0.05)。与模型组相比,阿托伐组、骐龙血脉健方大、中、小剂量组ApoE-/-小鼠TC水平均显著降低(P<0.01);阿托伐组和骐龙血脉健方大剂量组TG、LDL-C水平与模型组相比亦明显降低(P<0.01),而骐龙血脉健方中、小剂量组TG、LDL-C水平与模型组无明显差异(P>0.05),其中骐龙血脉健大剂量组在TC、LDL-L水平方面降低幅度优于阿托伐组。结果表明,骐龙血脉健方大剂量组与阿托伐组动脉粥样硬化程度无明显差异,部分血脂指标降低情况不逊于甚至优于阿托伐他汀组,表明骐龙血脉健方在达到一定剂量水平时在降脂、改善动脉硬化方面疗效确切。

本研究显示,与模型组相比,阿托伐组、骐龙血脉健方大剂量组和中剂量组Ox-LDL水平均有所下降(P<0.05),而以骐龙血脉健方大剂量组Ox-LDL水平下降最明显(P<0.01)。与模型组相比,阿托伐组和骐龙血脉健方大剂量组主动脉CD36蛋白表达均显著降低(P<0.05)。而骐龙血脉健方大剂量组降低Ox-LDL水平和CD36蛋白表达方面效果与阿托伐组无显著差异(P>0.05)。

有研究表明,活血化瘀药物能够有效降低动脉粥样硬化模型血脂水平和主动脉Ox-LDL表达[18],而活血化痰中药合理配伍使用对Ox-LDL诱导的内皮损伤有保护作用[19]。不同研究表明,活血化瘀中药对CD36表达呈下调作用[20,21],抑制泡沫细胞的形成,延缓动脉硬化的进展。本研究结果证实了骐龙血脉健方调节ApoE-/-小鼠血脂水平和抗动脉粥样硬化的效果,并提示骐龙血脉健方可能通过降低血清Ox-LDL水平、下调主动脉CD36蛋白表达,抑制泡沫细胞形成,从而抑制动脉粥样硬化的发展速度的作用机制,为中医药治疗动脉粥样硬化的研究提供了一定的参考。