HPLC法同时测定枫香树叶中3种黄酮类成分

王 亚(无锡市第八人民医院中医科,无锡 214000;通讯作者,E-mail:737259639@qq.com)

枫香树叶系金缕梅科枫香属植物枫香(Liqui-dambar formosana Hance)的叶,具有祛风除湿、行气止痛、解毒之功效[1],在我国江西、广西、广东、海南等地广泛分布,野生资源极其丰富,既是中成药肠炎宁系列品种的主要组成药,也可制成止血消炎制剂,还常用于急性胃肠炎、痢疾、产后风等疾病的治疗,是极具开发价值的一味中药[2-4]。研究表明,枫香树叶中主要含有山奈素、金丝桃苷、杨梅苷等黄酮类以及没食子酸等酚酸类成分[5,6]。目前,2014年版《江西省中药材标准》[7]收载的枫香树叶还未建立含量测定控制方法,仅有学者对枫香树叶中杨梅苷、异槲皮苷和山柰酚-4′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷3个黄酮苷类成分进行了HPLC含量测定研究[8]。药理活性研究表明,金丝桃苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷、山奈酚3个黄酮类成分具有神经保护、抗炎、抗氧化、抗肿瘤等多种药理活性,常作为中药或中成药质量控制的指标成分[9,10]。鉴于枫香树叶市场需求巨大、药材产地分布广泛,为确保药用质量,故本实验建立了HPLC同时测定枫香树叶药材中金丝桃苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷、山奈酚3个黄酮类成分的含量方法,为枫香树叶药材的质量控制和资源开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

Waters2695高效液相色谱仪(PAD检测器,Waters公司);CPA225D型十万分之一电子天平(德国赛多利斯);KQ-500DE型超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司)。

对照品金丝桃苷(批号111521-201708)、山奈酚-3-O-芸香糖苷(批号111869-201601)、山奈酚(批号110861-201611)均购自中国食品药品检定研究院,枫香树叶采自江西(以采集时间为批号,即批号200923代表样品采集于2020年9月23日,本实验所采集样品批号分别为200923,200618,210315,200914,201127),自然阴干后经黄平老师鉴定为枫香属植物枫香(Liquid-ambar formosana Hance)的叶。甲醇为色谱纯,磷酸等其他试剂均为分析纯,水为自制超纯水。

1.2 方法

1.2.2 混合对照溶液的制备 取金丝桃苷对照品8.26 mg、山奈酚-3-O-芸香糖苷对照品12.38 mg、山奈酚对照品2.82 mg,置于50 ml量瓶中,加70%甲醇至刻度,制成质量浓度分别为165.2,247.6,56.4 μg/ml的混合对照品溶液,4 ℃保存备用。

1.2.3 供试品溶液的制备 取粉碎后(过四号筛)的枫香树叶1.0 g,置25 ml量瓶中,加入70%甲醇25 ml,称重,超声处理(功率250 W,频率40 kHz)30 min,冷却,称重,用70%甲醇补失减失重,摇匀,过滤,取继滤液,作为供试品溶液。

2 结果

2.1 专属性试验

分别取“1.2.2”项下混合对照品溶液、“1.2.3”项下供试品溶液,按“1.2.1”色谱条件分别进样10 μl,采集色谱图。对照品溶液与供试品溶液中3种成分色谱峰保留时间一致(见图1),表明方法专属性良好。

1.金丝桃苷(hyperin);2.山奈酚-3-O-芸香糖苷(kaempferol-3-O-rutin);3.山奈酚(kaempferol)图1 对照品与供试品色谱图Figure 1 HPLC chromatograms of reference substance and test substance

2.2 线性关系考察

分别精密吸取“1.2.2”项下溶液0.1,0.5,1.0,2.0,5.0,10.0 ml至10 ml容量瓶中,加70%甲醇至刻度,制得不同浓度混合对照品溶液。分别吸取不同浓度对照品溶液各10 μl注入液相色谱,以峰面积Y对进样浓度X进行线性回归计算,结果金丝桃苷,山奈酚-3-O-芸香糖苷、山奈酚在质量浓度为1.652～165.2 μg/ml,2.476～247.6 μg/ml,0.564～56.4 μg/ml范围内与峰面积呈良好线性关系,回归方程分别为Y=28 641X+1 425(R2=0.999 2),Y=26 157X-2 946(R2=0.999 4)和Y=38 462X+4 255(R2=0.999 4)。

2.3 精密度试验

精密吸取“1.2.2”项下混合对照品溶液,按“1.2.1”项下色谱条件进样测定,重复进样6次,测定金丝桃苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷、山奈酚峰面积,结果见表1,其含量的RSD值分别为1.94%,0.68%,2.09%。表明仪器精密度良好。

表1 三种被测成分精密度试验结果 (n=6)

2.4 稳定性试验

取同一批号样品制成供试品溶液,按“1.2.1”项下色谱条件分别在0,2,4,6,8,12,24 h进样,测定金丝桃苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷、山奈酚峰面积,结果见表2,计算其含量的RSD值分别为1.52%,1.06%,2.23%。表明3种成分在70%甲醇溶液中24 h内稳定。

2.5 重复性试验

取同一批次(批号200923)样品制成供试品溶液,按“1.2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液,进样测定金丝桃苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷、山奈酚峰面积,结果见表3,计算其含量的RSD值分别为0.97%,1.49%,1.05%。表明方法重复性良好。

表2 三种被测成分稳定性试验结果

表3 三种被测成分重复性试验结果 (n=6)

2.6 加样回收试验

取已知含量(批号200923)的样品6份,每份约0.5 g,按1 ∶1的比例加入金丝桃苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷、山奈酚3种对照品,按“1.2.3”项下方法制备供试品溶液,按“1.2.1”项下色谱条件分析,计算回收率,结果见表4。

表4 三种被测成分加样回收率试验结果 (n=6)

2.7 样品含量测定

取不同批次样品约1.0 g,每个批次平行3份,按“1.2.3”项下方法制备供试品溶液,按“1.2.1”项下色谱条件分析,测定结果见表5。结果显示,不同采集时间的枫香树叶药材中金丝桃苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷、山奈酚含量存在显著差异,其中3月份(批号210315)采集的样品中金丝桃苷和山奈酚-3-O-芸香糖苷含量较高。

表5 样品中3种成分的含量测定结果 (n=3,mg/g)

3 讨论

3.1 被测样品的采集

据报道,不同采集时间下枫香树叶药材有效成分的含量存在显著差异。为阐明不同采收时间3种被测成分的含量差异,本实验收集了不同时间采集的枫香树叶样品,以采集时间编定样品批号,共收集了5个不同采收时间被测样品。

3.2 检测波长的选择

金丝桃苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷和山奈酚分别在360,346,360 nm波长处有最大吸收。本实验分别对346 nm和360 nm波长进行考察,发现在360 nm波长下3个被测化合物的HPLC图谱基线平稳,特征性强,峰型较好。因此选择360 nm作为检测波长。

3.3 样品溶剂的选择

为尽可能提取出3种被测成分,本实验对提取溶剂(甲醇、乙醇)、溶剂浓度(60%甲醇、70%甲醇、80%甲醇、90%甲醇、纯甲醇)、提取时间(15,30,45,60 min)以及料液比(1 ∶10,1 ∶15,1 ∶20,1 ∶25,1 ∶50)进行了考察,结果发现在以70%甲醇、1 ∶25为料液比、30 min为提取时间的条件下3个被测成分的含量最大。

3.4 色谱条件的选择

分别考察了不同比例的甲醇-磷酸水、甲醇-醋酸水和乙腈-磷酸水、乙腈-醋酸水为流动相系统,酸水浓度分别为0.1%和0.5%,结果发现,使用甲醇-0.5%磷酸水能减少拖尾现象,且响应值较高,溶剂毒性小,峰的分离度与峰形均较好,且无干扰峰。

4 小结

枫香树叶药材资源丰富、药用价值较高,既是中成药肠炎宁系列品种的主要组成药[11],也因含有天然黑色素而常被民间用作食物着色的色素原料,还能泡水饮用,用于有效预防中暑[12]。本研究首次建立了HPLC法同时测定枫香树叶药材中金丝桃苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷、山奈酚3种黄酮类成分的方法,所建立的方法具有良好的精密度、稳定性、重复性及回收率,表明检测方法可行。应用所建立的方法测定不同采集时间枫香树叶药材中3种成分的含量,结果显示在3月份采收时金丝桃苷和山奈酚-3-O-芸香糖苷的含量最高,在9月份采集时山奈酚的含量最高。为枫香树叶药材的质量控制、采集时间等提供了科学的依据,为枫香树叶资源的进一步开发利用提供了理论基础。