母体肥胖对胚胎神经管发育及线粒体结构和功能的影响*

路志国， 吴晓婷， 霍 泉， 李 婷， 鲁 瑶， 尹荷晴， 王 凯， 杜 勇△

（1宁夏医科大学临床医学院，宁夏 银川 750004；2宁夏医科大学总医院小儿外科，宁夏 银川 750004）

肥胖是一种由遗传、环境、饮食等因素引起的慢性代谢性疾病［1-2］，据估计到2025 年，全球男性肥胖率将达到18%，女性为21%［3］。妊娠期肥胖不仅有妊娠并发症［4］、妊娠期糖尿病［5］、分娩并发症［6］和感染［7］的风险，而且对后代的发育和健康也有影响［8-9］，包括神经发育障碍（包括脑性瘫痪）、冠心病、中风、2型糖尿病和哮喘等［10-11］。由于目前对神经发育障碍的治疗有限，妊娠期肥胖对胎儿神经系统发育的影响尤其令人担忧。因此，有必要深入了解妊娠期肥胖对后代神经发育的影响及其具体机制，从而实施有效的预防策略和早期干预。

神经系统的发育始于胚胎早期，发育过程中容易受到外部因素的影响，如孕期接触农药、辐射、用药、饮酒、感染和营养不良等因素［12］，导致神经管发育相关基因的结构改变或表达障碍，从而导致神经管缺陷的发生［13］。研究发现，在调整年龄、职业、文化程度、家庭收入、叶酸使用等因素后，与正常体重相比，孕前肥胖孕妇的胚胎出现神经管缺损的风险显著增加［14］。研究发现，母亲肥胖可能与胎儿脊柱裂风险增加有关，母亲体重不足可能与胎儿无脑风险增加有关［15］。也有研究发现母体肥胖可通过改变表观遗传机制导致胚胎神经发育障碍，如胚胎神经管缺陷（neural tube defects，NTDs）、自闭症、唐氏综合征、Rett 综合征以及随后的神经心理缺陷［16］。这些研究表明，母体肥胖可能会影响子代神经系统的发育，导致神经管畸形等出生缺陷，但具体机制尚不清楚。因此，本研究旨在探讨高脂饮食诱导的母体肥胖对胚胎神经管发育的影响及其可能机制，为研究神经管畸形的发病机制提供线索。

材料和方法

1 材料

1.1 实验动物16 只SPF 级雌性C57BL/6J 小鼠（6周龄，19～21 g），随机分为正常饮食（normal diet，ND）组及高脂饮食（high-fat diet，HFD）组，每组8只。两种饮食具体配方如表1 所示。所有动物饲养在宁夏医科大学实验动物中心，室温（22±2）℃，昼夜各12 h 明暗交替。动物实验方案经宁夏医科大学实验动物使用与管理委员会批准，批准号为IACUC-NYL‑AC-2020-066。

表1 饮食配方Table 1.Diet formula

1.2 主要试剂全蛋白提取试剂盒购自凯基生物公司；枸橼酸钠抗原修复液、DAB 显色液、山羊血清购自中杉金桥公司；HE 染色试剂盒、改良油红O 染色试剂盒、线粒体提取试剂盒、线粒体膜电位检测试剂盒、ATP 检测试剂盒购自碧云天公司；抗nestin、Bax、Bcl-2、GAPDH 抗体购自Abcam 公；高脂饲料购自北京科澳协力饲料有限公司。

2 实验方法

2.1 动物分组将16 只SPF 级雌性C57BL/6J 小鼠随机分为ND 组及HFD 组，每组8只分别给予高脂饲料和正常饲料。每周在特定时间测量小鼠体重，连续喂食12周后，于晚上8点将雌鼠与雄鼠合笼，次日上午8 点观察有阴栓的雌鼠记为妊娠第0.5 天。妊娠第14.5 天后腹腔注射1% 戊巴比妥钠（0.05 mg/g）麻醉，分离血液、肝脏和胚胎，其中ND 组共获得73只胚胎，HFD 组共获得70 只胚胎。用显微镊在解剖显微镜下划开背部皮肤，小心剥离出胚胎神经管用于后续实验。

2.2 血脂测量采用全自动生化分析仪检测两组血清中甘油三酯（triglyceride，TG）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、高密度脂蛋白胆固醇（high-density liptein cholesterol，HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（low-density liptein cholesterol，LDL-C）的含量。

2.3 HE 染色将分离的肝脏和胚胎在4% 多聚甲醛溶液中固定24 h，然后用新鲜PBS 溶液冲洗。乙醇梯度（乙醇浓度70%、80%、90%、95%、100%、100%）脱水，二甲苯透明，然后在65 ℃下浸泡石蜡Ⅰ和Ⅱ融化2 h 后包埋。将切好的石蜡切片在65 ℃烘箱中干燥2 h，二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，蒸馏水浸泡1 min，苏木精染色3 min，1% 盐酸乙醇分化，伊红染色3 min。经梯度乙醇脱水后，用二甲苯透明和中性树脂密封。最后，在光学显微镜下观察和拍照。

2.4 油红O 染色将剩余完整的肝脏用4% 多聚甲醛固定，然后OCT 包埋剂滴入组织。组织被完全覆盖并迅速冷冻，用冷冻切片机切片，厚度为4 μm。将切好的冰冻切片放入切片架回温10 min。配制油红O 染色工作液，用滤纸过滤备用。加入适量染色洗涤液，覆盖样品20 s 后吸出。加入适量染色洗涤液覆盖样品20 s 后吸除染色洗涤液，将配制好的油红O 染色工作液滴加于切片上染色20 min，去除工作液，将适量染色洗涤液滴加于切片上，静置30 s，浸入蒸馏水中置于摇床洗涤20 s。用苏木精染色液对细胞核复染，封片，在显微镜下观察拍照。

2.5 免疫组化染色将石蜡切片后烘烤2 h，乙醇梯度脱水（乙醇浓度100%、100%、95%、90%、80%、70%），枸橼酸钠抗原修复液高压修复10 min，使用3% H2O2去除内源性过氧化物酶，然后用山羊血清封闭30 min，滴加兔来源的nestin Ⅰ抗（1∶300）4 ℃孵育过夜。PBS 清洗后滴加Ⅱ抗。DAB 显色后苏木素复染，乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片后显微镜下观察、拍照。用ImageJ 软件分析染色单位面积百分比。

2.6 Western blot使用全蛋白提取试剂盒将神经管在4 ℃裂解缓冲液中匀浆，在12 000 ×g离心5 min后取上清液进行Western blot。用BCA 蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。蛋白质通过SDS-PAGE 分离，转移到PVDF 膜。用5% 脱脂奶粉封闭1 h 后，分别用 抗Bax（1∶1 000）、Bcl-2（1∶1 000）、nestin（1∶1 000）、GAPDH（1∶1 000）抗体孵育过夜，PBS 清洗后用HRP标记的Ⅱ抗孵育、化学发光，经ImageJ软件统计分析每组蛋白的相对表达量。

2.7 透射电镜观察超微结构将分离的胚胎神经管迅速置于戊二醛中2 h后用PBS清洗3次。用四氧化锇固定，脱水，包埋，HITACHI-7650 透射电子显微镜观察切片胚胎神经管的发育和线粒体的超微结构。

2.8 线粒体膜电位（mitochondrial membrane poten‑tial，MMP）的检测按照线粒体提取试剂盒说明书进行，首先称取100 mg 的新鲜胚胎神经管组织，PBS冲洗后用滤纸吸干，用剪刀剪碎，加入线粒体分离试剂A，在冰浴上进行匀浆后收集匀浆液。在1 000 ×g，4 ℃离心5 min。收集上清在11 000 ×g，4 ℃再次离心10 min。小心去除上清，沉淀即为分离得到的线粒体，收集沉淀立即用于MMP的检测。

MMP 的检测参照线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）说明书进行，步骤如下：（1）配制JC-1 染色工作液，取50 μL 200×的JC-1 加入8 mL 超纯水稀释后充分混匀，然后再加入2 mL 5×的JC-1 染色缓冲液，混匀后即为JC-1染色工作液；（2）把配制好的JC-1染色工作液再用1×的JC-1 染色缓冲液稀释5 倍。取0.9 mL 5 倍稀释的JC-1 染色工作液加入到0.1 mL 之前纯化的线粒体；（3）用多功能酶标仪进行检测，结果以相对荧光单位（relative fluorescence unit，RFU）表示。同时将加了工作液的纯化线粒体滴加在载玻片上，应用激光共聚焦显微镜进行观察，拍照。

2.9 ATP 含量检测按照ATP 检测试剂盒（碧云天）说明书，步骤如下：（1）每20 mg 神经管组织加入约200 μL 裂解液，充分匀浆确保组织被完全裂解。裂解后4 ℃、12 000×g离心5 min，取上清，用于后续的测定。（2）配制ATP 检测工作液：取50 μL ATP 检测试剂加入5 mL ATP 检测试剂稀释液配制成5 mL ATP 检测工作液；（3）ATP 浓度的测定：加100 μL ATP 检测工作液到检测孔内，室温放置5 min，在检测孔内加上20 μL 样品或标准品，迅速混匀，用多功能酶标仪测定相对数值，绘制标准曲线，并根据标准曲线计算出每组ATP的含量。

3 统计学处理

采用SPSS 19.0 统计软件进行分析。定量资料以均数±标准差（mean±SD）表示，两组间均数比较首先进行正态性检验，满足正态性则进行两样本t检验，若不满足则进行秩和检验，以P<0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 成功构建小鼠肥胖模型

ND 组及HFD 组小鼠的体重增量分别为（4.47±0.65）g和（7.02±0.51）g，HFD组较ND组增重明显，见图1A；ND 组及HFD 组小鼠血脂中的TC 分别为（2.9±0.32）mmol/L 和（4.74±0.17）mmol/L，TG 分别为（0.25±0.1）mmol/L 和（0.72±0.26）mmol/L，HDLC 分 别 为（1.51±0.35） mmol/L 和（2.76±0.27）mmol/L，LDL 分别为（0.31±0.1）mmol/L 和（1.16±0.18）mmol/L，见图1B；肝脏HE 和油红O 染色结果显示，ND 组小鼠肝小叶结构规则，肝细胞排列有序，大小均匀，以中心静脉为中心呈放射状排列；而HFD组小鼠肝细胞排列无序，细胞核转移由于脂肪空泡的影响，肝细胞肿胀，显示弥漫性脂肪变性，胞浆丰富大小不同的圆形的脂质滴，见图1C、D。

Figure 1.Identification of obesity mouse model induced by high-fat diet（NFD）.A：body weight；B：blood lipid level；C：liver HE staining of maternal mice in normal diet（ND）and HFD groups（×200）；D：liver oil red O staining of maternal mice in ND and HFD groups（×200）.Mean±SD. n=8.*P<0.05，**P<0.01 vs ND group.图1 高脂饮食诱导肥胖小鼠模型的鉴定

2 高脂饮食引起的肥胖引起子代神经管发育不良

胚胎神经管HE 染色结果显示，两组神经管细胞排列紧密，无核溶解、固缩现象，形态结构无明显差异，见图2A。免疫组化检测两组nestin 蛋白表达水平分别为（16.17±1.28）%和（22.19±1.27）%，HFD组较ND 组显著升高，见图2B，Western blot 检测ND组及HFD 组nestin 的相对蛋白表达水平分别为（0.26±0.03）和（0.62±0.08），见图2C。透射电镜显示两组胚胎神经管的突触前膜和后膜清晰可见，但HFD 组突触间隙消失，有一定程度的融合，神经管的发展有明显的缺陷（红色箭头所示，见图3A）。

Figure 2.High-fat diet（HFD）-induced obesity caused neural tube dysplasia in offspring.A：HE staining of embryonic neural tubes in normal diet（ND）and HFD groups（×400）；B：the protein expression levels of nestin in embryonic neural tubes were de‑tected by immunohistochemistry staining（×400）；C：the protein expression levels of nestin in embryonic neural tubes were detected by Western blot.Mean±SD. n=8.**P<0.01 vs ND group.图2 高脂饮食引起的肥胖导致子代神经管发育不良

3 高脂饮食诱导的肥胖导致后代线粒体结构紊乱，神经管细胞凋亡增多

透射电镜观察线粒体超微结构发现ND 组神经管线粒体呈卵圆形，线粒体嵴正常。而HFD 组神经管线粒体水肿，可见大量空泡，线粒体嵴破裂、模糊甚至消失，变形、增大，结构明显异常（红色箭头所示，见图3B）。Western blot结果表明ND组与HFD组小鼠胚胎神经管的Bax/Bcl-2 蛋白表达比值分别为（0.48±0.04）和（2.35±0.16），见图3C，表明高脂饮食引起的母体肥胖可导致子代神经管凋亡细胞增加。

4 高脂饮食引起的肥胖导致后代神经管线粒体功能紊乱

激光共聚焦显微镜观察显示，与ND 组相比，HFD 组线粒体膜电位降低，红色荧光（JC-1 聚合物）减弱，绿色荧光（JC-1 单体）增强。荧光酶标仪检测ND 组及HFD 组的红色荧光值分别为（44575±1543）和（30450±1230），ATP含量分别为（0.13±0.02）μmol/L 和（0.05±0.02）μmol/L，HFD 组均较ND 组降低，见图4。以上结果表明，高脂饮食引起的肥胖可引起子代神经管线粒体功能紊乱。

Figure 3.High-fat diet（HFD）-induced obesity led to the disorder of mitochondrial structure and the increase of cell apoptosis in neu‑ral tube of offspring.A：observation of embryonic neural tube development by electron microscopy（×8 000）；B：ultrami‑croscopic observation of embryonic mitochondrial structure by electron microscopy（×8 000）；C：the protein levels of Bax and Bcl-2 in embryonic neural tube were detected by Western blot.Mean±SD. n=8.**P<0.01 vs normal diet（ND）group.图3 高脂饮食诱导的肥胖引起子代神经管线粒体结构紊乱，细胞凋亡增加

讨 论

肥胖已经成为一个严重的公共健康问题［17］，孕妇超重和肥胖的发生率逐年增加［18］。研究发现，肥胖母亲与后代患NTDs 的风险之间存在剂量-反应关系，后代患NTDs的OR 值随BMI的增加而迅速增加，尤其是当BMI≥30 kg/m2时［19］。此外，一项荟萃分析发现，母亲肥胖与后代神经管缺陷风险增加显著相关［20］。也有研究发现在神经管闭合过程中ATP 含量显著增加，说明在神经管发育过程中需要更多的能量来保证神经细胞的正常分化和发育［21］。这些研究表明，神经系统的发育容易受到母体能量代谢的影响。然而，母体肥胖导致子代神经管缺陷发生率增加的机制尚不清楚。

Figure 4.High-fat diet（HFD）-induced obesity led to the functional disorder of mitochondria in neural tubes of offspring.A：the mito‑chondrial membrane potential of embryonic neural tubes was observed by confocal microscopy（×200），and the red-green fluorescence intensity of JC-1-stained embryonic neural tubes was detected by multifunctional microplate reader；B：the ATP content in embryonic neural tubes was determined by multifunctional microplate reader.Mean±SD. n=3.*P<0.05，**P<0.01 vs normal diet（ND）group.图4 高脂饮食引起的肥胖导致子代神经管线粒体功能紊乱

本研究首先通过12 周的高脂肪饮食构建肥胖小鼠模型，发现HFD 组体重、血脂明显高于ND 组，肝脏HE 及油红O 染色也显示大量的脂肪堆积在肝细胞，表明高脂肪饮食成功诱导小鼠肥胖模型。接下来，将满足上述条件的雌鼠与成年雄鼠合笼，使其妊娠。在妊娠8.5～10.5 d是小鼠胚胎神经管发育的关键时期，在妊娠14.5 d神经管已充分发育，因此我们选择E14.5 d神经管为研究样本［22］。nestin被广泛认为是神经干细胞的标记物。它在神经胚形成时开始表达，随着神经干细胞的逐渐迁移和分化，nestin的表达逐渐减少，并在神经干细胞分化后停止表达。因此我们在E14.5 d分离神经管，进行HE染色、免疫组织化学染色、Western blot 发现nestin 在HFD 组的表达高于ND 组，提示子代神经管发育异常。同时，我们利用透射电镜观察超微结构，发现两组神经管的突触前膜和后膜清晰可见，但HFD 组突触间隙消失，有一定程度的融合。我们还发现HFD 组神经管线粒体结构紊乱，出现线粒体水肿，出现大量空泡，线粒体嵴断裂、模糊甚至消失，这与课题组之前的研究结果一致［23］。

众所周知，形态和结构的改变往往伴随着功能的改变，因此我们进一步检测了两组神经管的线粒体功能。线粒体膜电位的维持对线粒体功能至关重要，因此线粒体膜电位水平被认为是线粒体的健康指标［24］。JC-1 是一种理想的荧光探针，广泛用于检测线粒体膜电位［25］。当线粒体膜电位较高时，JC-1在线粒体基质中聚集形成聚合物，可产生红色荧光。相反，当膜电位较低时，JC-1 以单体形式存在，可发出绿色荧光。因此，可以通过荧光的颜色变化来检测线粒体膜电位［26］。本研究中HFD组线粒体膜电位明显低于ND 组。此外，我们还测量了神经管中细胞的ATP 含量，因为充足的ATP 供应对神经细胞的发育和分化至关重要。我们发现HFD组ATP含量明显低于ND 组，这与我们观察的线粒体膜电位结果一致，反映出肥胖小鼠胚胎神经管线粒体功能受损。

一般来说，线粒体膜电位的降低是凋亡的特异性早期指标之一［27］。细胞凋亡又称程序性细胞死亡，在机体发育过程中普遍存在，在调节胚胎发育、细胞更新、维持细胞数量等方面发挥着重要作用［28］。细胞凋亡发生在神经管形成到神经系统发育的过程中。在这一过程中，细胞增殖与凋亡之间存在着动态平衡，保证了神经管的正常分化和发育。当这种不平衡被破坏时，就会导致神经管缺陷［29-30］。因此，当线粒体膜电位降低时，我们进一步检测凋亡相关标志物的表达。Bcl-2 家族在细胞凋亡线粒体通路中起重要作用，其中Bcl-2是主要的抗凋亡因子，Bcl-2 家族中的Bax 是促凋亡蛋白［31］，因此Bax/ Bcl-2 值是评价多种因素介导的细胞凋亡的重要指标［32］。Western blot 结果显示，与ND 组相比，HFD 组Bax 升高，Bcl-2降低，Bax/Bcl-2比值升高，说明HFD 组神经管细胞凋亡增加。结合前期nestin检测结果，我们可以得出母体肥胖时胚胎神经管发育不良，细胞凋亡增多，打破了正常发育的平衡。

综上所述，高脂饮食诱导的母体肥胖影响了子代神经管线粒体的结构和功能，进而激活线粒体凋亡通路，导致细胞凋亡增加，最终影响子代神经管的发育。然而，母体肥胖引起的胚胎神经管发育不良是由母体胰岛素还是瘦素引起，尚不清楚，需要进一步研究。本研究为神经管缺损的发病机制研究提供了理论依据，同时也提示孕妇应建立健康的生活和饮食习惯，保持能量平衡，改善母体肥胖对后代神经发育的不良影响。