鹿红方调控Nrf2因子保护缺血/再灌注损伤心肌细胞的机制研究

蔡 婉，葛 文，王 婧，周 华，池 浩

急性心肌梗死(acute myocardial infraction，AMI)是指冠状动脉急性缺血、缺氧导致的心肌坏死，是冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)的一种危急重症。经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention，PCI)使急性心肌梗死的治疗取得了巨大进步，早期冠状动脉血运重建已使AMI的死亡率下降，但有研究表明，PCI术后1年内病死率高达7%～12%和心力衰竭发生率为22%[1]，早期血运重建后心律失常发生率较高[2]。心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)的机制包括氧化应激损伤、炎症反应、细胞毒性以及细胞凋亡等，其中氧化应激损伤作为一个重要因素，氧自由基的大量增加破坏线粒体膜结构，导致钙超载和线粒体内膜电位的崩溃，从而导致心肌细胞损伤及死亡[3-4]。

研究表明，Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Keap-1)/核因子相关因子-2(Nrf2)/抗氧化结合原件(ARE)信号通路在抗氧化损伤中有重要作用[5]。Nrf2因子是机体内维持氧化还原反应的主要因子之一，当细胞内氧自由基增加时，Nrf2从Keap-1上撤离，移位至细胞核中，与ARE结合，启动下游抗氧化蛋白、解毒酶等基因表达，从而发挥抗氧化的作用[6]。既往研究表明，Nrf2信号通路的激活可明显改善心肌梗死后小鼠的心功能，Nrf2基因敲除后，小鼠快速发展为心力衰竭，死亡率也随之增加[7-8]。Nrf2因子通过抗氧化应激反应从而达到保护心肌细胞的作用[7，9]。

中药复方鹿红方具有成分复杂及作用途径、靶点多样等特点，主要用于胸痹心痛、喘证等的治疗，临床研究表明，鹿红方能够有效改善心肌梗死后心力衰竭的临床症状，调节冠状动脉微循环[10]，鹿红方预处理可以提高小鼠抗氧化应激水平[11]。本研究基于机体内抗氧化信号通路，采用大鼠结扎前降支复制心肌缺血再灌注损伤模型及H9c2心肌细胞缺氧/复氧模型，鹿红方药物干预，观察小鼠心肌梗死面积、心肌细胞凋亡率、氧化因子以及Nrf2信号通路相关蛋白表达，在动物及细胞水平探讨鹿红方对心肌缺血再灌注损伤心肌细胞的保护作用。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 无特定病原体(SPF)级Wistar雄性大鼠40只，体质量(220±20)g，实验动物购自北京维通利华实验动物技术有限公司上海分公司(动物生产许可证号：SCXK<沪>2017-00，11；使用动物许可证号：SCXK<沪>2020-0002)；清洁级健康成年雄性SD大鼠20只，体质量(220±20)g，购自上海中医药大学实验动物中心(使用动物许可证号：SYXK<沪>2014-0008)。所有动物均饲养于上海中医药大学实验动物中心无菌级动物房，室温(23±2)℃，湿度(55±5)%，普通饲料喂养，自由饮水。实验过程中所有操作均符合实验动物伦理委员会规定。

1.2 实验细胞 H9c2心肌细胞购自Lonza公司。将保存于液氮中的H9c2细胞于37 ℃水浴中震荡融化，吸出细胞悬液于37 ℃培养箱中培养传代，细胞传代4～5代后分装于冻存管中冻存备用。

1.3 实验试剂及设备

1.3.1 实验试剂 2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC，购自美国Sigma公司，批号：BCBW5177)；肌酸激酶同工酶(CK-MB)试剂盒(购自南京建成生物工程研究所，批号：20180115)；乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒(购自南京建成生物工程研究所，批号：20171203)；心肌肌钙蛋白I(cTnI)试剂盒(购自南京建成生物工程研究所，批号：20170927)；谷胱甘肽(GSH)试剂盒(购自南京建成生物工程研究所，批号：20180803)；丙二醛(MDA)(购自南京建成生物工程研究所，批号：20180406)；超氧化物歧化酶(SOD)(购自南京建成生物工程研究所，批号：20170916)；亚铁离子(Fe2+)(购自南京建成生物工程研究所，批号：20180129)；RIPA裂解液(购自上海碧云天生物科技有限公司，批号：P0013C)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒(购自上海碧云天生物科技有限公司，批号：P0012)；SLC7A11抗体(购自美国Affinity公司，批号：AF6139)；GPX4抗体(购自美国Affinity公司，批号：AF0120)；Nrf2抗体(购自美国Affinity公司，批号：AF9294)。Annexin V-PE/7-AAD 凋亡检测试剂盒(购自上海经科化学科技，批号：AD10-2)。

1.3.2 实验设备 小动物呼吸机[世联博研(北京)科技有限公司生产，型号：SAR-830/Ap]；低温高速离心机(赛默飞生产，型号：Sorvall Stratos)；酶标仪(美国Molecular device公司生产，型号：pectramax M5)；高速组织研磨仪(武汉谷歌生物科技有限公司生产，型号：IS2000MM)；电泳仪(美国Bio-Rad公司生产，型号：Powerpac Universal)；电子秤(上海耀壮检测仪器设备有限公司生产，型号：PL303-IC)；透射电子显微镜(日本JEOL公司生产，型号：JEM-2000Ex)；荧光显微镜(奥林巴斯生产，型号：CX23BG)。

1.4 实验药物

1.4.1 药物制备 鹿红方由上海中医药大学附属曙光医院制剂室提供，由鹿角片、红花、仙灵脾、补骨脂、女贞子、山萸肉、沉香按15∶9∶30∶20∶30∶15∶6 比例配制。鹿红方水提物制备方法如下：将药材置于不锈钢锅中，加适量水浸泡1 h，置于电磁炉上，先用大火煮沸后，再用小火保持微沸煎煮1 h，18层纱布过滤，滤液备用；另外再加适量水同法再煎煮1次，18层纱布滤过，合并两次药液，于60 ℃旋转蒸发仪减压浓缩至干，在60 ℃真空干燥，干膏称重，再碾为均匀细粉，制成干燥浸膏粉备用。

1.4.2 鹿红方含药血清的制备 将20只清洁级健康成年雄性SD大鼠适应性喂养1周后，灌服鹿红方药液，灌胃药液各中药含量为：鹿角0.15 g/mL，红花0.09 g/mL，补骨脂0.2 g/mL，仙灵脾0.3 g/mL，女贞子0.3 g/mL，山萸肉0.15 g/mL，沉香0.06 g/mL，每次20 mL/kg，每日1次，连续灌胃5 d，在最后1 d灌胃1 h后用水合氯醛麻醉，经腹主动脉取血，进行血清分离，56 ℃水浴加热30 min灭活，-20 ℃保存备用。

1.5 造模及干预方法

1.5.1 实验动物分组与造模 将40只SPF级Wistar雄性大鼠随机分为对照组、缺血再灌注模型组(模型组)、鹿红方低剂量组、鹿红方中剂量组、鹿红方高剂量组，每组8只。按大鼠和人的换算量灌胃给予对应药物(低剂量=人给药剂量/体重×6.25)，中、高剂量分别为低剂量的2倍及4倍。鹿红方低剂量组、鹿红方中剂量组、鹿红方高剂量组分别给予鹿红方干燥浸膏粉剂量2.1 g/kg、4.2 g/kg、8.4 g/kg灌胃，对照组、模型组给予等量生理盐水灌胃，每日1次，持续灌胃7 d，最后1次给药后12 h行缺血再灌注造模。结扎大鼠前降支30 min后复灌24 h后结束造模[12]，对照组除不结扎前降支外，余操作同前。

1.5.2 H9c2 心肌细胞缺氧/复氧模型构建 将H9c2心肌细胞分为对照组、模型组、鹿红方低剂量组、鹿红方中剂量组、鹿红方高剂量组。鹿红方低剂量组、鹿红方中剂量组、鹿红方高剂量组加入6%、12%、18%鹿红方含药血清预处理24 h。缺氧/复氧处理：将模型组、鹿红方低剂量组、鹿红方中剂量组、鹿红方高剂量组细胞培养液更换为不含胎牛血清的培养液，将细胞培养板水平放置，滴入2 mL左右的液体石蜡，分别封闭12 h进行缺氧处理后，吸除石蜡，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗3次，更换为含有10%胎牛血清培养基，置培养箱培养4 h即为复氧。

1.6 检测指标及方法

1.6.1 大鼠心肌梗死面积测定 各组大鼠复灌24 h结束造模后，取出大鼠心脏，PBS洗净，置于-80 ℃冰箱30 min后取出，从心尖向心底部方向连续切成2 mm左右的薄片，将薄片放入2%TTC溶液中，37 ℃预热；放入装有10%甲醛的离心管中过夜，将心脏切片按照一定顺序拍照，Image J软件分析心肌梗死面积，红色区代表非梗死心肌组织，白色区代表梗死心肌。心肌梗死面积=梗死心肌面积/左心室面积。

1.6.2 苏木精-伊红(HE)染色观察各组大鼠心肌组织病理学改变 各组取出大鼠心脏，预冷PBS洗净，4%的多聚甲醛室温固定24 h后取出，逐级乙醇脱水，石蜡包埋并切成6 μm左右的切片。切片烘干后脱蜡、乙醇水化处理。以苏木精染色10 min，1%伊红染色3 min，经二甲苯透明化、树脂封片，光镜下观察心肌形态。

1.6.3 DNA 断裂的原位末端标记(TUNEL)染色观察并检测各组大鼠心肌细胞凋亡情况 取出大鼠心脏，预冷PBS洗净，4%的多聚甲醛室温固定24 h，冰冻切片，经二甲苯浸洗，逐级乙醇脱水，双氧水-甲醇浸泡，在0.1%TritonX-100、0.1%缓冲液固定5 min，PBS反复漂洗3次后加入TUNEL液，反应1 h，PBS漂洗，逐级乙醇脱水，经二甲苯透明化、树脂封片，在荧光显微镜下观察各组心肌细胞凋亡情况。

1.6.4 血清SOD、MDA、GSH和Fe2+水平检测 10%水合氯醛麻醉，腹主动脉采血，静置后，3 500 r/min离心25 min，-80 ℃保存。采用比色法检测各组小鼠血清中SOD、MDA、GSH及Fe2+水平，严格按照试剂盒说明书进行检测。

1.6.5 蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测Nrf2和Keap-1蛋白表达水平 全自动蛋白印迹定量分析系统检测主动脉组织中Nrf2、Keap-1蛋白表达水平。取大鼠主动脉组织，培养H9c2心肌细胞，取上清液，使用蛋白提取试剂盒提取蛋白，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，将分离得到的蛋白通过湿法转移到疏水性的聚偏二氟乙烯膜；用转移到膜上的蛋白当作抗原，使之与第一抗体相结合后再与荧光标记的第二抗体杂交结合，最后通过底物显色以检测目的蛋白的表达水平。将导出的图片用Image J软件进行扫描，得到蛋白条带灰度值，然后计算出每个蛋白条带对应的蛋白表达量，将所得数值用GraphPad Prism软件绘制出不同蛋白表达量的统计图。

1.6.6 细胞增殖毒性检测(CCK-8)法检测细胞存活 PBS清洗培养皿，胰酶消化细胞，将细胞悬液接种于96孔板上，每孔约100 μL，每孔加入10 μL CCK-8溶液。在37 ℃、5%CO2、饱和湿度培养箱内孵育2 h。酶标仪检测吸光度(波长45 mm)。

1.6.7 流式细胞术检测细胞凋亡 收集细胞培养液上清液，胰酶消化细胞，观察到贴壁细胞开始脱落时终止消化。1 000 r/min离心5 min，弃去培养液。取细胞悬液195 μL，加入5 μL细胞凋亡检测试剂混匀，1 000 r/min离心5 min沉淀细胞，加入10 μL 水溶性染色剂4 ℃避光下孵育20 min，流式细胞检测细胞凋亡。

1.6.8 H9c2心肌细胞培养基中MDA、SOD、LDH含量检测 低速离心取培养液上清液，采用试剂盒法检测培养液中LDH含量，采用比色法检测心肌细胞内MDA含量，采用黄嘌呤氧化法检测心肌细胞内SOD含量。

2 结 果

2.1 各组大鼠心肌梗死面积比较 与对照组比较，模型组心肌梗死面积明显增大，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，鹿红方低剂量组、鹿红方中剂量组、鹿红方高剂量组心肌梗死面积减小，差异有统计学意义(P<0.05)。与鹿红方低剂量组比较，鹿红方中剂量组、鹿红方高剂量组心肌梗死面积减小，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

表1 各组大鼠心肌梗死面积比较(±s)

2.2 各组大鼠心肌组织病理学改变 HE染色光镜观察，对照组大鼠心肌细胞结构完整，排列整齐清晰，细胞间质无水肿，横纹肌规则且清晰。模型组大鼠心肌细胞肿胀，排列紊乱，部分核膜破裂、消失，可见心肌细胞呈现凋亡状态，出现炎性细胞浸润；鹿红方低剂量组可见心肌细胞肿胀，排列不规则，间质水肿及细胞外基质增多，并由炎性细胞浸润；鹿红方中、高剂量组心肌细胞肿胀减轻，排列较规则，炎性细胞浸润明显减少，细胞凋亡状态明显改善。详见图1。

2.3 各组大鼠血清氧化因子比较 与对照组比较，模型组血清SOD、GSH含量减低，血清MDA含量升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，鹿红方低剂量组、鹿红方中剂量组、鹿红方高剂量组血清SOD、GSH水平升高，血清MDA含量减低，差异均有统计学意义(P<0.05)。与鹿红方低剂量组比较，鹿红方中剂量组、鹿红方高剂量组血清SOD、GSH水平升高，血清MDA含量降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表2。提示心肌缺血再灌注损伤后心肌细胞内抗氧化作用减少，细胞修复功能受损，脂质过氧化作用增强。鹿红方低、中、高剂量预处理能有效减少心肌缺血再灌注损伤心肌组织中MDA生成，提高SOD、GSH含量，减少细胞氧化应激反应，维持细胞氧化和抗氧化水平平衡，以鹿红方中、高剂量预处理效果最优。

表2 各组大鼠血清SOD、MDA、GSH含量比较 (±s)

2.4 各组大鼠心肌凋亡情况比较 TUNEL染色显示，与对照组比较，模型组大鼠心肌细胞凋亡率明显升高，实验造模成功。与模型组比较，鹿红方低剂量组、鹿红方中剂量组、鹿红方高剂量组大鼠心肌细胞凋亡率明显降低；与鹿红方低剂量组比较，鹿红方中、高剂量组大鼠心肌细胞凋亡率进一步降低。详见图2。提示心肌缺血再灌注导致心肌细胞凋亡，鹿红方低、中、高剂量预处理均能减少心肌缺血再灌注导致的心肌细胞凋亡，以鹿红方中、高剂量效果最明显。

图2 鹿红方H/R诱导对心肌细胞凋亡的影响

2.5 各组H9c2心肌细胞的存活率比较 通过CCK-8检测发现，与对照组比较，模型组H9c2心肌细胞存活率明显降低，实验造模成功。与模型组比较，鹿红方低剂量组、鹿红方中剂量组、鹿红方高剂量组H9c2心肌细胞存活率均升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与鹿红方低剂量组比较，鹿红方中剂量组、鹿红方高剂量组H9c2心肌细胞存活率较高，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表3。提示缺氧/复氧导致H9c2心肌细胞存活率下降，鹿红方低剂量组、鹿红方中剂量组、鹿红方高剂量组预处理均能增加缺氧/复氧H9c2心肌细胞存活率，以鹿红方中、高剂量组最有效。

表3 各组H9c2心肌细胞存活率比较 (±s)

2.6 各组H9c2心肌细胞凋亡情况比较 在流式细胞散点图上，以膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V)为横轴，碘化丙淀(PI)为纵轴，左下象限显示正常细胞，右上象限是凋亡中晚期和坏死细胞，即细胞凋亡情况。通过流式细胞检测发现，与对照组比较，模型组H9c2心肌细胞凋亡明显升高，显示造模成功；与模型组比较，鹿红方低剂量组、鹿红方中剂量组、鹿红方高剂量组H9c2心肌细胞凋亡均有所降低，以鹿红方中、高剂量组降低最明显(见图3)。提示缺氧/复氧导致H9c2心肌细胞凋亡，鹿红方低、中、高剂量预处理均能减低缺氧/复氧H9c2心肌细胞凋亡，以鹿红方中剂量组、鹿红方高剂量组最明显。

图3 流式细胞术检测各组H9c2心肌细胞凋亡情况

2.7 各组H9c2心肌细胞中SOD、MDA含量与H9c2心肌细胞培养上清液中LDH含量比较 与对照组比较，模型组H9c2心肌细胞中MDA含量升高、SOD含量下降，上清液中LDH含量升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，鹿红方低剂量组、鹿红方中剂量组、鹿红方高剂量组MDA含量下降、SOD含量升高，上清液中LDH含量降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；与鹿红方低剂量组比较，鹿红方中剂量组、鹿红方高剂量组H9c2心肌细胞中MDA含量下降，SOD含量升高，上清液中LDH含量下降，差异均有统计学意义(P<0.05)。提示缺氧/复氧后H9c2心肌细胞内抗氧化作用减少，细胞修复功能受损，脂质过氧化作用增强，鹿红方低、中、高剂量预处理能有效减少细胞内MDA生成，提高SOD含量及降低上清液中LDH含量，减少细胞氧化应激反应，减轻心肌细胞膜受损程度，维持细胞氧化和抗氧化水平平衡，以鹿红方中、高剂量预处理效果最优。详见表4。

表4 各组H9c2心肌细胞中SOD、MDA，上清液中LDH含量比较 (±s)

2.8 各组大鼠梗死心肌组织及H9c2心肌细胞中Keap1、Nrf2蛋白表达比较 通过对大鼠梗死心肌组织与H9c2心肌细胞中蛋白检测发现，与对照组比较，模型组Keap1蛋白表达增高，Nrf2蛋白表达降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，鹿红方低剂量组、鹿红方中剂量组、鹿红方高剂量组Keap1蛋白表达降低，Nrf2蛋白表达增高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与鹿红方低剂量组比较，鹿红方中剂量组、鹿红方高剂量组Keap1蛋白表达降低，Nrf2蛋白表达增高，差异均有统计学意义(P<0.05)。提示小鼠缺血再灌注损伤心肌与缺氧/复氧H9c2心肌细胞抗氧化应激水平降低，鹿红方低、中、高剂量预处理能增加Nrf2蛋白表达，增加抗氧化应激水平，以鹿红方中、高剂量组最有效。详见图4、表5、表6。

图4 心肌组织与H9c2心肌细胞中Keap-1、Nrf2蛋白定量条带图

表5 各组大鼠心肌组织中Keap-1、Nrf2蛋白表达比较 (±s)

表6 各组H9c2心肌细胞中Keap-1、Nrf2蛋白表达比较 (±s)

2.9 各组大鼠心肌组织及H9c2心肌细胞中Fe2+水平比较 与对照组比较，模型组梗死心肌组织中Fe2+水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，鹿红方低剂量组、鹿红方中剂量组、鹿红方高剂量组Fe2+水平降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；与鹿红方低剂量组比较，鹿红方中剂量组、鹿红方高剂量组Fe2+水平降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表7。提示心肌缺血再灌注受损心肌组织中Fe2+沉积，可能是导致心肌再灌注损伤的原因，鹿红方低、中、高剂量预处理能有效减少梗死心肌组织中Fe2+沉积，以鹿红方中、高剂量预处理效果最优。

表7 各组大鼠心肌组织中Fe2+浓度比较(±s) 单位：mmol/L

与对照组比较，模型组缺氧/复氧H9c2心肌细胞中Fe2+水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，鹿红方低剂量组、鹿红方中剂量组、鹿红方高剂量组缺氧/复氧H9c2心肌细胞Fe2+水平降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；与鹿红方低剂量组比较，鹿红方中剂量组、鹿红方高剂量组缺氧/复氧H9c2心肌细胞Fe2+水平降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表8。提示缺氧/复氧H9c2心肌细胞中Fe2+离子沉积，可能是导致心肌细胞缺氧/复氧损伤的原因，鹿红方低、中、高剂量预处理能有效减少缺氧/复氧H9c2心肌细胞中Fe2+沉积，以鹿红方中、高剂量预处理效果最优。

表8 各组H9c2心肌细胞中Fe2+浓度比较(±s) 单位：mmol/L

3 讨 论

AMI是临床上常见的危急重症，中医上归属于“胸痹”“真心痛”范畴，基本病因多为本虚标实，正气亏虚，气滞、寒凝、痰浊、瘀血等痹阻心脉[12]。鹿红方由鹿角、红花、山茱萸、沉香等药物组成，方中鹿角温补肝肾、益精养血，红花活血化瘀、通经止痛，共为君药；山茱萸、补骨脂温补肾阳，女贞子滋补肝肾，寓“阴中求阳”之义，为臣药；少佐沉香温经行气止痛，增强红花活血化瘀之功，具有“补中寓行、补而不滞”的作用。前期研究证实，鹿红方可通过减轻氧化应激反应，抑制心肌细胞凋亡及自噬，从而减轻H9c2心肌细胞的缺氧/复氧损伤[13-14]。

MIRI的病理机制涉及氧化应激、炎症反应、细胞凋亡等多方面，在MIRI的发生发展中都起重要作用。当MIRI发生时，心肌内产生大量的活性氧(ROS)，导致线粒体损伤、钙超载、细胞凋亡，所有氧化应激是MIRI发生的关键环节。ROS升高导致心肌细胞凋亡和坏死[3，15]。本研究证明，H9c2心肌细胞缺氧复氧模型中，与对照组比较，模型组心肌细胞培养基上清液H9c2心肌细胞中LDH含量明显升高，心肌细胞中MDA含量升高，SOD含量降低，而鹿红方可有效降低细胞培养基中LDH及心肌细胞中MDA含量，升高SOD含量，以鹿红方中剂量及高剂量组效果最优。在MIRI模型中，与对照组比较，模型组GSH、SOD含量明显减低，MDA含量明显升高，而鹿红方可以有效降低梗死心肌组织MDA含量，升高SOD及GSH活性，以鹿红方中剂量及高剂量组效果最优。此外，HE染色及TUNEL染色表明，鹿红方低、中、高剂量都能有效缓解MIRI导致的心肌细胞水肿、坏死及凋亡。流式细胞检测表明，鹿红方各剂量能抑制H9c2缺氧/复氧心肌细胞凋亡，表明鹿红方可以通过抑制氧化应激反应从而减轻心肌缺血再灌注损伤。

在缺血再灌注损伤过程中，氧化应激过程是关键环节[16]，而Keap-1/Nrf2/ARE信号通路是机体中最重要的抗氧化信号通路，Nrf2因子是机体内维持氧化还原反应的主要因子之一[6]，当细胞内氧自由基增加时，Nrf2从Keap-1上撤离，移位至细胞核，与ARE结合，启动下游抗氧化蛋白及解毒酶，从而发挥抗氧化作用。本研究表明，在H9c2心肌细胞缺氧/复氧模型及MIRI模型中，与对照组比较，模型组Nrf2蛋白表达水平降低，鹿红方各剂量都能上调Nrf2蛋白表达水平，增强抗氧化作用，以鹿红方中剂量及高剂量效果最优。因此，鹿红方可以上调Nrf2抗氧化信号通路，抑制氧化应激反应。

综上所述，鹿红方可以明显抑制心肌缺血再灌注损伤导致的氧化应激反应，减轻心肌损伤，其机制可能与上调Nrf2抗氧化信号通路有关。此外，本实验发现，与对照组比较，模型组心肌细胞及心肌组织中Fe2+含量明显升高。而Fe2+水平升高导致细胞脂质过氧化可以引起细胞铁死亡的发生。此外，铁死亡相关蛋白的表达受Nrf2水平调控[6]。因此，鹿红方减轻心肌缺血再灌注损伤的机制是否与铁死亡相关，尚需进一步的实验研究证明。