基于网络药理学及分子对接探讨乌丹降脂胶囊治疗非酒精性脂肪肝的作用机制※

李圣豪 戴慕巍 王 芳 冯彩霞 贾彦生 王 超 郝立园 李耀琪 闫会敏

(1.河北省石家庄市第五医院药剂科，河北 石家庄 050021；2.河北医科大学第四医院骨科，河北 石家庄 050011；3.河北医科大学流行病学教研室2020级硕士研究生，河北 石家庄 050017；4.河北省石家庄市第五医院消化内镜室，河北 石家庄 050021；5.河北中医学院2019级硕士研究生，河北 石家庄 050200；6.河北医科大学流行病学教研室2021级硕士研究生，河北 石家庄 050017；7.河北省石家庄市第五医院临床医学研究所，河北 石家庄 050021)

非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是指除外酒精及其他的肝损伤因素导致肝细胞内脂肪过度沉积为主要特征的综合征，与胰岛素抵抗和遗传易感性密切相关的获得性代谢应激性肝损伤[1]，与肥胖、2型糖尿病和心血管疾病关系密切[2]。NAFLD在全球的患病率约为25%，是肝硬化和肝细胞癌的主要原因[3]。西医方面主要采用保肝药、抗氧化剂、脂代谢调节剂等药物治疗，尚无特效药物[4]，由于其不良反应多，单一药物无法满足，治疗效果欠佳。

NAFLD在中医上归属于“积证”“痰证”范畴，其疾病性质本虚标实，本虚为阳气不足，标实为痰湿、瘀血、气滞等[5]。乌丹降脂胶囊为河北省石家庄市第五医院自制的中药制剂，由山楂、决明子、陈皮、法半夏、茯苓、泽泻、丹参、大黄、茵陈、黄芪、北柴胡、何首乌、炙甘草13 味中药组成(国家专利号：CN201310063372.4)，具有健脾化痰、活血化瘀功效[6]。本研究拟应用网络药理学和分子对接方法，借助药物和疾病等多个数据库，构建乌丹降脂胶囊成分与靶点网络，并采用分子对接技术验证乌丹降脂胶囊与核心靶点的关系，较为整体地预测乌丹降脂胶囊治疗NAFLD的机制。

1 资料与方法

1.1 乌丹降脂胶囊活性成分筛选及靶点获取 中医药百科全书(The Encyclopedia of Traditional Chinese Medicine，ETCM，http://www.tcmip.cn/ETCM/index.php/Home/)数据库[7]采用多种权威算法计算药物动力学参数、药物相似度及预测作用靶点。本研究利用ETCM数据库获取乌丹降脂胶囊13味中药的活性成分和作用靶点。

1.2 NAFLD靶点的获取 以“nonalcoholic fatty liver disease”和“NAFLD”为疾病检索词，分别在The Human Gene Database(GeneCards，https://www.genecards.org/)[8]、Online Mendelian Inheritance in Man(OMIM，https://omim.org/)和Therapeutic Target Database数据库(TTD，http://db.idrblab.net/ttd/)[9]进行搜索，收集疾病相关靶点。根据GeneCards数据库score值≥中位数的靶点设定是NAFLD的潜在靶点。合并以上3个疾病数据库，并且删除重复条目，得到NAFLD的靶点。

1.3 “药物-疾病”交集靶点获取 将获取的乌丹降脂胶囊靶点与NAFLD靶点通过Venn(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)[9]取交集并绘制Venn图。

1.4 “药物-成分-靶点”网络图的构建和分析 将以上步骤得到的药物有效活性成分、交集靶点进行数据整合。运用 Cytoscape 3.8.2[10]软件绘制“药物-成分-靶点”网络图。利用Cytoscape 3.8.2软件中“Network Analyzer”的功能，计算出不同节点的度(Degree)值，根据Degree值的大小排序，筛选前3位作为乌丹降脂胶囊的核心活性成分。

1.5 蛋白质与蛋白质相互作用(PPI)网络构建及分析 将药物与疾病的交集靶点提交到STRING 11.5数据库(https://cn.string-db.org/)[11]，限定物种为 “Homo sapiens”，且“medium confidence = 0. 4”，去除游离的靶点，构建PPI网络图。此外，使用Cytoscape 3.8.2中的MCODE插件分析PPI网络，确定关键功能模块；同时还应用Cytoscape 3.8.2的插件CytoHubba计算出Degree值较高的前10个核心靶点。

1.6 交集靶点的基因本体(GO)富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析 将药物与疾病交集靶点输入到Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery database(DAVID，https://david.ncifcrf.gov/)数据库[12]，进行GO和KEGG分析。物种限定为“Homo Sapiens”，以P<0.05且靶点数(count值)≥10为筛选条件，并应用bioinformatics(http://www.bioinformatics.com.cn/)进行可视化。GO分为三大类，分别是生物学过程(biological process，BP)、细胞组分(cellular component，CC)和分子功能(molecular function，MF)。

1.7 分子对接的验证 为了更加进一步评价药物活性成分与靶点的结合能力，进行了分子对接的验证。应用PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)[13]下载活性成分的2D结构，导入Chem3D软件调整其空间构象，进行能量最优化。Uniprot数据(https://www.uniprot.org/)[13]中寻找核心靶点对应蛋白，然后通过PDB数据库(https://www.rcsb.org/)下载靶蛋白结构。在PyMol软件中除去水分子和小分子配体，使用AutoDock Tools 1.5.6软件添加氢键，最后对受体和配体进行分子对接，从而得到分子对接的数值。

2 结果

2.1 乌丹降脂胶囊相关活性成分和作用靶点的获得 通过ETCM数据库，获得乌丹降脂胶囊中山楂活性成分为28个，决明子活性成分为24个，陈皮活性成分为12个，半夏活性成分为21个，茯苓活性成分为32个，泽泻活性成分为21个，丹参活性成分为35个，大黄活性成分为79个，茵陈活性成分为40个，黄芪活性成分为24个，何首乌活性成分为18个，柴胡活性成分为41个，甘草活性成分为64个。将这13味中药活性成分合并后删除重复值，获得393种活性成分和812个作用靶点。应用Cytoscape 3.8.2中“Network Analyzer”对乌丹降脂胶囊活性成分和作用靶点分析，基于它们之间的Degree值、邻域连通性(Neighborhood connectivity)和紧密中心性(Closeness centrality)，按照Degree值≥70筛选出21个乌丹降脂胶囊的主要活性成分，见表1。

表1 乌丹降脂胶囊主要活性成分(前21个)

2.2 NAFLD相关靶点获得 应用GeneCards 数据库获得1091个NAFLD相关靶点，根据score值≥中位数视为NAFLD潜在靶点，在GeneCards数据库，NAFLD相关靶点中score最大值是19.15，最小值是0.12，中位数是0.35。然后将GeneCards、TTD和OMIM数据库靶点合并删除重复值，最终获得1142个NAFLD相关的靶点。

2.3 “药物-疾病”交集靶点筛选 将预测的乌丹降脂胶囊药物的靶点(812个)与NAFLD疾病的靶点(1142个)取交集，得到乌丹降脂胶囊与NAFLD交集靶点107个，并绘制Venn图，见图1。

图1 乌丹降脂胶囊和NAFLD靶点的Venn图

2.4 “药物-成分-靶点”的网络构建和分析 通过对“药物-疾病”交集靶点进行反向推导，得到乌丹降脂胶囊作用于NAFLD的活性成分有382个。使用 Cytoscape 3.8.2软件将382个活性成分和107个“药物-疾病”交集靶点进行关联，并构建“药物-成分-靶点”网络图，见图2(红色为药物，蓝色为成分，紫色为靶点)。图中包括462个节点和1958条边，一个节点Degree值越大则表示该成分发挥作用的可能性越大，或者是该靶点与疾病的相关性越大。进一步应用 Cytoscape 3.8.2中“Network Analyzer”功能筛选，筛选出乌丹降脂胶囊治疗NAFLD的核心活性成分，分别是阿里红酸(Officinalic acid)、棕榈酸(Cetylic acid)和辛酸(Caprylic acid)。

图2 药物-成分-靶点网络图

2.5 PPI网络构建及分析 将107个靶点导入STRING11.5数据库中，获得PPI网络，并导入 Cytoscape 3.8.2软件进行可视化，见图3A(由绿色到蓝色，Degree值越来越大。颜色越深，Degree值越大)。最终该PPI网络图共包括102个节点，773条边。靶点以节点表示，靶点间相互作用关系以每个节点之间的线条表示，靶点相互作用强度以Degree值表示，其值越大，作用越强。节点的颜色与节点的Degree值成正比，即Degree值越大，节点颜色越深。由于 PPI 网络中蛋白的作用是相互的，为了能更加精确地分析乌丹降脂胶囊治疗NAFLD的作用机制，在得到乌丹降脂胶囊和NAFLD交集靶点的PPI网络后，进行聚类构建功能模块构建。因此，运用Cytoscape 3.8.2软件中MCODE插件，得到 5个关键模块，每个模块中的蛋白有着更为紧密的联系，共同执行着某个生物过程，见图3B。此外，运用插件CytoHubba计算出得分较高的前10个核心靶点，包括过氧化物酶体增殖物激活受体α(peroxisome proliferator activated receptor alpha，PPARA)、胰岛素(insulin，INS)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator activated receptor gamma，PPARG)、白细胞介素6(interleukin 6，IL-6)、Toll样受体4(toll like receptor 4，TLR4)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)、细胞色素P450家族2亚科E成员1(cytochrome P450 family 2 subfamily E member 1，CYP2E1)、肌动蛋白β(actin beta，ACTB)、白蛋白(albumin，ALB)和热休克蛋白90α家族A级成员1(heat shock protein 90 alpha family class A member 1，HSP90AA1)，见图3C(由黄色变红色，Degree值由小变大)。

注：A 药物-疾病交集靶点PPI网络图；B MCODE分析PPI网络图；C 前10个核心靶点

2.6 交集靶点的GO富集分析和KEGG富集分析 将药物与疾病的107个交集靶点基因导入DAVID数据库，进行GO功能注释。根据P值和count值进行筛选，选择有统计学意义的 BP、CC、MF条目绘制柱形图，颜色越红，P值越小，柱形越长，count值越大。结果显示BP包括16个条目，CC包括17个条目，MF包括10个条目。其中BP主要集中在外来物质的代谢过程(Xenobiotic metabolic process)、细胞对脂多糖的反应(Cellular response to lipopolysaccharide)、对外来刺激的反应(Response to xenobiotic stimulus)、脂质代谢过程(Lipid metabolic process)、翻译起始(Translational initiation)、药物反应(Response to drug)、细胞因子介导的信号通路(Cytokine mediated signaling pathway)、基因表达的正向调节(Positive regulation of gene expression)、RNA聚合酶Ⅱ启动子的转录正调控(Positive regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱ promoter)、炎性反应(Inflammatory response)、负调控凋亡过程(Negative regulation of apoptotic process)、DNA模板的转录正调控(Positive regulation of transcription, DNA-templated)、嗜中性粒细胞脱颗粒(Neutrophil degranulation)、DNA模板的转录负调控(Negative regulation of transcription, DNA-templated)、RNA聚合酶Ⅱ启动子的转录负调控(Negative regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱ promoter)和细胞分化(Cell differentiation)等，见图4A；CC主要集中在细胞外泌体(Extracellular exosome)、粘着斑(Focal adhesion)、膜(Membrane)、胞质(Cytosol)、内质网(Endoplasmic reticulum)、内质网腔(Endoplasmic reticulum lumen)、细胞质(Cytoplasm)、大分子复合物(Macromolecular complex)、胞外区(Extracellular region)、内质网膜(Endoplasmic reticulum membrane)、细胞外间隙(Extracellular space)、核(Nucleus)、核浆(Nucleoplasm)、细胞表面(Cell surface)、胞质核周区(Perinuclear region of cytoplasm)、染色质(Chromatin)和细胞内细胞器(Intracellular membrane-bounded organelle)等，见图4B；MF主要集中在RNA聚合酶Ⅱ转录因子活性，配体激活序列特异性DNA结合(RNA polymerase Ⅱ transcription factor activity, ligand-activated sequence-specific DNA binding)、相同蛋白的结合(Identical protein binding)、RNA结合(RNA binding)、氧化还原酶活性(Oxidoreductase activity)、蛋白质同源二聚化活性(Protein homodimerization activity)、酶结合(Enzyme binding)、蛋白结合(Protein binding)、锌离子结合(Zinc ion binding)、转录因子活性、序列特异性DNA结合(Transcription factor activity, sequence-specific DNA binding)和ATP结合(ATP binding)等，见图4C。

注：A为BP分析；B为CC分析；C为MF分析

应用DAVID数据库进行KEGG通路富集分析，根据P值和count值筛选有明显统计学差异的通路，共有7条。7条通路分别是细胞色素P450对外来生物的代谢(Metabolism of xenobiotics by cytochrome P450)、酒精性肝病(Alcoholic liver disease)、PPAR信号通路(PPAR signaling pathway)、冠状病毒病-COVID-19(Coronavirus disease - COVID-19)、胰岛素抵抗(Insulin resistance)、脂质和动脉粥样硬化(Lipid and atherosclerosis)和代谢途径(Metabolic pathways)，见图5。结果表明这些通路可能是研究乌丹降脂胶囊治疗NAFLD主要通路。

图5 KEGG富集分析图

2.7 分子对接验证 为了进一步验证乌丹降脂胶囊对NAFLD的治疗作用，借助 AutoDock Vina 软件进行分子对接，将Degree值最高的核心活性成分阿里红酸、棕榈酸和辛酸分别与10个核心蛋白进行分子对接。研究表明靶点蛋白与活性成分的最低结合能小于-5 kcal/mol认为二者结合稳定[14]，且结合能数值越低，构象越稳定 (见表3)，其中阿里红酸与PPARA、CYP2E1、TNF、ACTB和ALB的结合性最好，PyMol软件进行可视化，见图6。由图可知，阿里红酸与PPARA在VAL-407、HIS-411处形成氢键； 阿里红酸与PPARG在GLN-451处形成氢键；阿里红酸与TNF在GLN-355处形成氢键；阿里红酸与ACTB在ARG-254、ARG-75、PHE-106处形成氢键；阿里红酸与ALB在LYS-190处形成氢键。

表2 核心活性成分与核心靶点的分子对接结果 kcal/mol

图6 核心活性成分阿里红酸与核心靶点的分子对接图

3 讨论

中医古籍中并无NAFLD记载，NAFLD在中医上归属于“胁痛”“肝着”“痰浊”“癥瘕”“积聚”“痰痞”“肥气”等范畴[15]。NAFLD主要病因是过食肥甘厚味，主要病机为肝郁脾虚，痰浊内蕴[16]。乌丹降脂胶囊具有健脾化痰、活血化瘀功效，方中陈皮理气燥湿，半夏燥湿化痰、散结消痞，茯苓健脾祛湿，使湿去脾旺，三药合用祛湿化痰，调节脾胃；山楂健脾开胃、消食化积、活血化瘀，黄芪益气健脾，泽泻利水渗湿，柴胡疏肝解郁，丹参活血化瘀，决明子润肠通便，茵陈清热利湿、退黄，大黄逐瘀攻积。诸药相合，既能益气健脾，行气散结，又能活血散瘀，利湿消积。

NAFLD的病理进展一般分为3个过程，即脂肪变性、脂肪毒性和炎症。脂肪变性、氧化应激和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、IL-6等炎症介质的存在与NAFLD中组成性活性/雄甾烷受体(constitutive active/androstane receptor，CAR)、孕烷X受体(pregnane X receptor，PXR)、PPARA等核因子的改变有关，这些因素可能导致药物代谢酶或转运体的表达和活性改变[17]。本研究中，网络药理学结果表明，乌丹降脂胶囊中有382个活性成分可用于NAFLD疾病的治疗，其中涉及107个靶点。前10个核心靶点分别为PPARA、PPARG、IL-6、TNF、INS、CYP2E1、ACTB、ALB、HSP90AA1和TLR4。其中，脂肪变性导致核因子κB(nuclear factor-kappaB，NF-κB)激活，进而激活TNF-α和IL-6等炎症因子，从而介导NASH中炎症发生[18]。TLR是一类模式识别受体家族，通过病原体相关的分子模式识别激活固有免疫系统[19]。TLR1-5在NAFLD中升高，促进NAFLD的发展[20]，而且TLR4通过激活X-box结合蛋白-1(X-box binding protein-1，XBP1)从而诱导非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)[21]。PPAR包括α、β、γ在脂肪酸分解代谢作用和戊糖磷酸能量代谢中发挥重要作用[22]。PPARA调节脂肪酸转运、线粒体β氧化和脂肪分解，其缺失导致非酒精性脂肪肝炎病变更加严重[23]。PPARG在脂肪组织中高度表达，在脂肪形成、脂肪细胞分化和脂质代谢的调节中发挥重要作用[24]。PPARG被激活后胰岛素敏感性提高，还促进脂肪细胞分化，增加脂肪组织对游离脂肪酸的摄取，加速NAFLD发展[25]。CYP2家族是最重要的药物代谢酶，CYP2E1是目前研究最多的与NAFLD相关的酶，研究显示人和啮齿类动物的NAFLD中，CYP2E1的表达和活性增强[26-27]。TNF-α是一种重要的促炎细胞因子，参与多种肝脏损伤。在啮齿动物的NAFLD模型中，TNF-α拮抗剂减轻肝脏炎症，甚至逆转脂肪变性[28]。TNF-α抑制剂还能改善非酒精性脂肪性肝炎患者的组织学特征[29]。ALB是最丰富的蛋白质，具有抗氧化、抗炎等多种功能。研究表明NAFLD患者的ALB(包括对金属和脂肪酸)的结合能力降低，因此，ALB结合功能可作为早期肝损伤的指标[30]。乌丹降脂胶囊能作用于这些靶基因，改善核因子释放、减少胰岛素抵抗、减少炎症因子释放、改善药物代谢酶等方面达到治疗NAFLD的目的。

GO分析的结果显示，乌丹降脂胶囊治疗NAFLD的靶点主要分布细胞质、细胞膜、内质网膜、细胞核、染色质等细胞组分；具有聚合酶Ⅱ转录因子活性、蛋白质同源二聚化活性、蛋白结合、锌离子结合、酶结合、ATP结合等分子功能；主要参与炎性反应、药物反应、细胞对脂多糖的反应、脂质代谢过程等生物学过程。由此可见乌丹降脂胶囊治疗NAFLD是通过参与多种细胞组分、多种分子功能、多种生物学过程发挥作用的。

KEGG通路富集结果表明，乌丹降脂胶囊通过细胞色素P450对外来生物的代谢、酒精性肝病、过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferators-activated receptors，PPAR)信号通路、新型冠状病毒肺炎、胰岛素抵抗、脂质和动脉粥样硬化以及代谢途径等通路达到治疗NAFLD的作用。已有研究表明胰岛素抵抗是NAFLD进展的关键，NAFLD与胰岛素抵抗密切相关，70%～80%的肥胖和糖尿病患者患有NAFLD[31-32]；而且炎症因子、胰岛素抵抗与NAFLD三者之间可能存在一定联系，TNF-α和IL-1β等炎症介质的分泌，导致胰岛素抵抗和NASH[33]。研究还表明，胰岛素抵抗可能诱导NAFLD中CYP2E1的高表达和高活性[34]，细胞色素P450(cytochromeP450，CYP450)是参与多种内源性和外源性化合物代谢的酶，主要在肝脏中表达[35]，CYP2E1介导活性氧(reactive oxygen species，ROS)的产生，促进NAFLD发展[36]。

此外，山楂是蔷薇科山里红或山楂的干燥成熟果实，气微清香，味酸、微甜。入肝、脾、胃经，具有消食健胃、行气散瘀功效，含有机酸类等活性成分，具有促进脂肪消化、降脂等作用，山楂对NAFLD有良好的治疗效果，在缓解氧化应激[37]、促进脂质代谢[38]、抑制血小板聚集[39]等多个方面产生治疗作用。前期研究发现，乌丹降脂胶囊能降低胰岛素、TNF-α和NF-κB表达，减轻炎性反应，促进肝细胞功能恢复[40]。本研究发现，阿里红酸与核心靶点具有较好的结合，表明乌丹降脂胶囊能通过多成分、多靶点治疗NAFLD。

综上所述，本研究应用网络药理学技术，初步探索了乌丹降脂胶囊对NAFLD治疗的多层次机制。该结果为进一步实验研究及临床应用提供一定依据，也为乌丹降脂胶囊治疗 NAFLD的研究提供一定思路。但是，本研究存在一定局限性，不同剂量可能产生不同的效果，数据库的不同也可能导致研究结果不一致，乌丹降脂胶囊含有的主要成分对于NAFLD的靶点是抑制作用还是促进作用尚不明确。因此，今后需进一步通过实验进行验证。