老年急性髓系白血病患者中医证型分布、遗传学检查及预后的临床分析

刘军霞 王德好 谌海燕 郭 明 谢佳烨 李 玲 廖俊尧 廖 婧 丁晓庆△

(1.北京中医药大学东方医院血液科，北京 100078；2.北京中医药大学2021级博士研究生，北京 100029；3.北京中医药大学2019级硕士研究生，北京 100029)

急性白血病(acute leukemia，AL)临床表现为贫血、出血、感染和发热[1]。急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)患者治疗过程中常病情复发导致治疗效果不佳，缩短了患者的生存时间，因此找出与预后相关的基因，对于预测患者生存周期，进而分层治疗具有重要意义[2]。WT1基因最早在Wilms瘤中被发现，分子质量约为50×103Da，位于人类染色体11p13，与瘤体病变密切相关。WT1基因在白血病中呈高表达，被称为“泛白血病”基因标志[3]。

AL疾病恶性程度较高，其在发病过程中容易并发感染、出凝血异常等疾病，导致患者预后较差，其中广泛出血以及形成微血栓表现的弥散性血管内凝血(disseminated intravascular coagulation，DIC)是出凝血异常并发症造成高死亡率和出血的重要原因，而大多数的AL患者均伴有不同程度的 DIC[4-7]。患者发生DIC时治疗难度较大，因此早期诊断、早期治疗是AML并发DIC 治疗的关键，临床中迫切需要有优势的 DIC 早期诊断指标。

本研究以老年AML患者为研究对象，回顾性探究中医证型分布规律及不同证型的预后特点，结合患者的基因及核型资料与住院期间的实验室检查结果，以期为AML的诊断和治疗提供指导。

1 资料与方法

1.1 病例来源 收集2009—2020年北京中医药大学东方医院血液科老年AML患者59例，男34例，女25例；在本院化疗26 例，未在本院化疗33例；在本院化疗患者中位年龄74.5岁，未在本院化疗患者中位年龄80岁。

1.2 病例选择

1.2.1 诊断标准 参照《血液病诊断及疗效标准》[8]中AML的诊断标准，分型标准参照AML 的法、美、英分型系统(French-American-British classification systems，FAB)分型[9]及世界卫生组织(WHO)分型(2016)[10]。中医证型标准参照《老年急性髓系白血病(非急性早幼粒细胞白血病)中西医结合诊疗专家共识》[11]，预后及分层参照《成人急性髓系白血病(非急性早幼粒细胞白血病)中国诊疗指南(2017年版)》[12]。

1.2.2 纳入标准 年龄>60岁；资料完整者。

1.2.3 排除标准 资料完整度不足以支撑完成后续分析者；FAB分型为M3型者。

1.3 治疗情况

1.3.1 中医治疗 化疗期予北京中医药大学东方医院血液科协定处方血证膏方。药物组成：炙黄芪 30 g，白术 15 g，陈皮15 g，茯苓15 g，生地黄15 g，白芍15 g，当归15 g，川芎15 g，党参15 g，何首乌15 g，枸杞子15 g，菟丝子15 g，红景天10 g。休疗期予骨髓增殖膏方。药物组成：炙黄芪30 g，白术15 g，陈皮15 g，茯苓15 g，生地黄15 g，白芍15 g，当归15 g，川芎15 g，党参15 g，丹参30 g，桃仁10 g，红花10 g，水蛭10 g，土鳖虫10 g，三棱10 g，莪术10 g，白花蛇舌草30 g，半枝莲30 g，山慈菇30 g，夏枯草10 g，青黛10 g。日 1 剂，水煎2次取汁300 mL，分早、晚2次服。

1.3.2 西医治疗 ≤75岁的老年患者，一般状况良好，预后及分层评估为良好者，一般选用“3+7”方案中的DA 方案(柔红霉素联合阿糖胞苷)、IA 方案(去甲氧柔红霉素联合阿糖胞苷)或 MA方案(米托蒽醌联合阿糖胞苷)。年龄>75岁的老年患者，一般状况差，预后及分层评估为不良的患者一般采用低强度化疗方案，主要有超小剂量地西他滨、小剂量CAG(阿克拉霉素、阿糖胞苷、粒细胞集落刺激因子)、阿扎胞苷、小剂量阿糖胞苷等。缓解后可继续原方案治疗，或使用阿糖胞苷中剂量或标准剂量巩固治疗。

1.3.3 随访 随访至2021年2月，时间终点为患者死亡。

1.4 西医疗效标准 参照《血液病诊断及疗效标准》[8]，完全缓解：无贫血出血，无感染等，男性血红蛋白(Hg)含量≥100 g/L，女性Hg含量≥90 g/L，骨髓中原始细胞≤5%，血小板计数(PLT)≥100×109/L，中性粒细胞绝对值>1.5×109/L，日常生活基本恢复；部分缓解：临床症状、体征及血细胞均有所改善，原始细胞在骨髓中达到5%～20%；未缓解：未达到以上标准。总有效率=(完全缓解例数+部分缓解例数)/总例数×100%。

1.5 统计学方法 应用 SPSS 20.0软件统计处理，计数资料采用χ2检验，小样本量采用Fisher精确概率法，计量资料首先进行正态分布分析，符合正态分布的根据资料是否为配对。中西医结合治疗老年AML回顾性研究37例分别采用独立样本t检验及配对样本t检验，不符合正态分布的根据数据采用配对样本的秩和检验或独立样本的秩和检验。应用Kaplan- Meier 法绘制生存曲线，同时采用Log-rank 检验比较不同组之间的差异。

2 结果

2.1 基本资料 本研究患者59例，其中化疗联合中药治疗26例，未化疗33例。化疗组患者中位年龄 74.5(63，88)岁，中位总生存期(overallsurvival, OS)为8个月。未化疗组患者中位年龄 80(60，95)岁，中位OS为1个月。年龄>75岁患者中位OS为6个月，年龄≤75岁患者中位OS为13个月，比较差异有统计学意义(P=0.040)。

2.2 缓解时间 患者在 4 个疗程内能得到总缓解(overall response，OR)的中位生存期为 16 个月，而在4个疗程内未得到OR的中位生存期为4 个月，比较差异有统计学意义(P=0.000)。

2.3 中医证候分析 59例老年AML患者中，邪盛正虚证35例(59%)，邪热炽盛证1例(2%)，气血两虚证19例(32%)，痰瘀互结证3例(5%)，痰瘀互结证兼邪热炽盛证1例(2%)。首次就诊患者中行基因检测者共40例，其中未突变患者 10 例(25%)，1 种及以上突变患者 30 例(75%)。分析检出基因突变与未检出突变基因的中医证型差异，未突变患者气血两虚证4 例(40%)，邪盛正虚证4例(40%)，痰瘀互结证1例(10%)，痰瘀互结证兼邪热炽盛证1例(10%)；突变患者气血两虚证11例(36.7%)，邪盛正虚证19例(63.3%)。WT1 突变 17 例(42.5%)，未突变患者 23 例(57.5%)，WT1突变患者气血两虚证8例，邪盛正虚证9例；WT1未突变患者气血两虚证7例，邪盛正虚证14例，痰瘀互结证1例，痰瘀互结证兼邪盛正虚证1例。使用 Fisher 精确概率法计算P值分别为0.687、0.509。其中 1 种、2 种、3 种及以上基因突变者气血两虚证及邪盛正虚证人数比分别为2/3、3/5 及2/5。其他突变有富丝氨酸/精氨酸剪接因子-2基因(serine and arginine rich splicing factor 2，SRSF2)突变 1 例，Runt相关转录因子1基因(runtrelated transcription factor 1，RUNX1)突变 3 例，额外性梳样基因(additional sex combs-like gene，ASXL)突变 5 例，CCAAT /增强子结合蛋白α基因(CCAAT/enhancer binding protein alpha，CEBPA)突变5 例，10-11易位基因 2 (ten-eleven translocation gene 2,TET2 )突变 5 例，核仁磷酸蛋白基因(nucleophosmin，NPM)突变 1 例，DNA甲基转移酶3α基因(DNA methyltransferase 3 alpha，DNMT3A)突变 4 例，黑色素瘤特异性抗原基因(preferentially expressedantigen of melanoma，PRAME)突变 3 例，异位病毒整合位点1基因(ecotropic viral integration site 1，EVI1)突变 3 例，植物同源结构域指蛋白6基因(the plant homeodomain finger protein 6，PHF6)突变 4 例，FMS样酪氨酸激酶 3 基因内部串联重复突变 3 例，Kit 原癌基因突变2例，神经纤维瘤蛋白1基因(neurofibromin 1，NF1)突变1例，集落刺激因子3受体基因(colony stimulating factor 3 receptor，CSF3R)突变1例，急性粒细胞白血病基因1/第8号染色体的ETO基因(myeloid leukemia 1, AML1/eight twenty one, ETO)融合1例，混合细胞系白血病部分串联重复基因(mixed-lineage leukemiapartial tandem duplication，MLL-PTD)高表达1例，髓系分化主要反应蛋白88基因(myeloid differentiation primary response 88，MYD88)突变1例，脆性组氨酸三联体(fragile histidine triad ，FHIT)/toll-白细胞介素1 受体域接头蛋白基因(toll-interleukin 1 receptor domain containing adaptor protein，TIRAP)融合1例，集落刺激因子3受体基因(colony stimulating factor 3 receptor，CSF3R)突变1例，U2 小核糖核蛋白辅助因子1(U2 small nuclear RNA auxiliary factor 1，U2AF1)突变1例，GATA结合蛋白2基因(GATA2)变异1例，信号转导因子和转录激活因子 5B(signal transducer and activator oftranscription 5B，STAT5B)突变1例。

纳入患者中行染色体检查者 34 例，0种突变人数 14 例(41%)，其中气血两虚证9例(26%)，邪盛正虚证4 例(12%)，痰瘀互结证1 例(3%)；1种及以上突变人数20例，其中气血两虚证3 例，邪盛正虚证16例，痰瘀互结证兼邪热炽盛证1例。8号染色体三体(+8)7 例，其中气血两虚证1 例，邪盛正虚证5例，痰瘀互结证兼邪热炽盛证1例；无8号染色体三体(+8)26 例，其中气血两虚证11 例，邪盛正虚证15 例，痰瘀互结证1 例。使用 Fisher 精确概率法计算P值分别为 0.004、0.370(见表1)。

表1 老年AML气血两虚证、邪盛正虚证遗传学分布

2.4 遗传学与生存期分析 通过 Log-rank 检验对 26 例化疗患者进行生存期分析。共纳入完整基因检测患者 24 例，其中 1 种及以上基因突变患者 19 例，基因检测未发现突变5例，结果显示2组患者生存期比较差异无统计学意义(P=0.729)；其中 WT1 突变阳性者 10 例，突变阴性者 14 例，结果提示 WT1 突变是影响老年 AML 患者生存期的因素(P=0.049)(见图1)；DNMT3A 及 RUNX1 突变患者生存期均未见明显差异(见表2)。共纳入完整检测染色体患者 20 例，其中发现染色体突变患者 9 例，未发现突变患者 11 例，结果显示2组患者生存期比较差异无统计学意义(P>0.05)；预后危险度中，预后不良组和预后良好及中等组、危险度评分中<9 分组及≥9 分组患者生存期均未见明显差异(P>0.05)。

表2 基因与生存期关系表

注：0代表无突变，1代表有突变

2.5 凝血与生存期分析 统计26例化疗患者入院后国际血栓与止血协会(ISTH)评分，将患者分为<5分组(22 例)及≥5分组(4例)，Log-rank 检验结果显示2组生存期比较差异有统计学意义(P=0.037)；将患者分为<4 分组(13例)及≥4 分组(13例)，Log-rank 检验结果显示2组生存期比较差异有统计学差异(P=0.003)。根据D-二聚体(D-D)水平分为≤1 mg/L组(13例)及>1 mg/L组(13例)，结果显示2组生存期比较差异有统计学意义(P=0.021)；发生出凝血异常12例，占接受化疗人数46%，未发生出凝血异常14例，占接受化疗人数54%，2组生存期比较差异有统计学意义(P=0.037)。见表3、图2～5。

表3 凝血与生存期关系表

注：0代表<5分，1代表≥5分

注：0代表<4分，1代表≥4分

注：0代表≥1 mg/L,1代表<1 mg/L

注：0=无，1=有

3 讨论

在AML患者中，<60岁患者的5年总生存率为40%～50%，>60岁患者的中位生存期<1年[13]。治疗方案结合患者的耐受性、危险分层和其他临床因素综合选择尤为重要。现有风险分层依赖于细胞遗传学研究和基因突变的分子检测，如FLT3-ITD、NPM1、CEBPA和KIT[14]。

本研究结果显示，老年AML患者中医证型分布存在气血两虚、邪盛正虚、痰瘀阻滞、邪热炽盛四种类型，其中气血两虚和邪盛正虚占比最大，这可能与本研究中选择的病例均为>60岁老年人有关。老年人普遍阴阳失衡，脏腑衰竭，临床以虚证为主，而正虚也可导致邪盛，即“因虚致实”。在本研究接受化疗的26例患者中，8个月的中位生存期与万伟等[15]研究结果近似。此外，是否存在染色体突变在气血两虚和邪盛正虚患者中存在统计学差异(P<0.05)，存在染色体突变患者在邪盛正虚患者中占比更大，这或许可以成为AML患者邪盛正虚和气血两虚的辨证的依据之一。而是否存在基因突变、基因突变的具体类型、是否存在+8突变在气血两虚和邪盛正虚患者中未见差异。方伟祯发现基因突变的数量在AML患者不同证型中存在差异，且气阴两虚型预后良好基因组(CEBPA、NPM1)比例显著增多，本研究在基因突变与其结果差异或许为本研究纳入病例数较少，每组基因突变样本不足导致。在接受化疗的26例病例中，不同证型间的生存期无明显统计学差异，而WT1基因突变阳性和阴性患者中位生存期分别为6个月和19个月，比较差异有统计学意义(P<0.05)。说明WT1基因突变与不良预后相关，具备老年AML患者临床危险分层的意义，这也与窦翠云等[2]研究结论相一致。而DNMP3A突变、RUNX1突变对生存期的影响不存在统计学差异(P>0.05)。46%的接受化疗的患者在治疗过程中发生出凝血异常，而ISTH评分≥4分，D-D>1 mg/L时，预后明显不良。以往研究证实，D-D水平可评价患者凝血及纤溶系统问题，是AL并发症评定的重要指标[16]。另有研究指出，D-D能及时有效地反映AML患者高凝状态或纤溶亢进状态[17]。本研究可被其他研究结果支持，具备参考价值。

WT1 基因可调节造血干细胞的数量、生长分化及生存，是双向转录因子，能抑制幼稚细胞的分化，同时也具有癌基因的特性[18]。目前有研究表明，在恶性造血系统疾病中，WT1 基因均异常高表达，在 AML 中表达最明显，相比其他类型恶性血液肿瘤有更重要的临床意义[19]。另有研究表明，超过70%的AML患者 WT1 高表达[20-21]。在骨髓增生异常综合征(MDS)中，WT1的表达与较高的原始细胞数和AML进展的风险增加相关[22]。多项研究表明，AML中WT1水平的增加与治疗抵抗、较高的复发率和总体生存率低有关[23-25]。此外，未能将WT1转录水平降低到可检测限度以下与AML复发率较高有关[26]。WT1对于微小残留病变的预后存在价值[27]。部分研究表明，更高的WT1表达对AML预后具有更大的预测意义[19, 23,27-29]，而另一些研究表明，更低的WT1表达对预后具有更大的预测意义[30-34]。目前部分研究表明，AML患者WT1基因突变后无病生存期(disease-free survival,DFS)和OS显著降低,WT1基因突变是AML不良预后的独立因素[35]。而WT1 基因的高表达也是异基因造血干细胞移植前后预后不良的因素[26]。本研究提示，WT1突变可影响老年患者的生存期，然而由于本研究样本量的限制，WT1对各型非M3，即非急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)的AML预后的影响有待于进一步的探究。

白血病患者在治疗过程中常发生出凝血异常，1/3的非APL的AML患者发生DIC，大约15%非APL的AML患者在诱导缓解化疗开始不久后发生DIC[36]，APL患者发生血栓事件(thromboticevents,TE)的患病率高于其他AL患者，报告的患病率在2%～15%[37]。AL合并DIC具有较高的病死率，可诱发致命性出血，导致患者预后较差[38]。

本研究一方面验证了出凝血异常常随AML进展而出现，一方面发现D-D>1 mg/L或ISTH评分≥4分时常与不良的临床结局相关。我们认为，D-D水平与ISTH评分在临床中可提示出凝血是否存在异常，进而可辅助出凝血异常相关疾病的诊断。血浆D-D被认为是鉴别原发性和继发性纤溶及监测溶栓治疗等方面的重要指标[39]，此指标已被大量研究证实可有效应用于多种恶性肿瘤疾病并发症的辅助诊断[40-41]。也有研究证实，该指标对AL患者并发症凝血及纤溶系统问题具有较高的诊断价值[42-43]。当发生纤维蛋白溶解过度时，91%的AML患者检测到D-D水平升高[44]。尽管单次检测不足以证实或否认DIC的诊断，但D-D仍被视为DIC诊断参考[45]。一项研究表明，D-D和可溶性p选择素作为生物标志物，与恶性血液病静脉血栓栓塞症(venous thromboembolism,VTE)相关，二者具有用于风险预测的可能[46]。

血液病合并DIC根据病程可分为3期：早期机体处于高凝状态，凝血活性增高，脏器微循环障碍形成微血栓，部分患者可能无明显症状，导致早期不易发现，检出难度高；中期为消耗性低凝期，患者已经出现不同程度的出血症状，可能形成脏器功能障碍，血小板减少，凝血因子消耗；晚期表现为严重的出血症及休克。恶性血液肿瘤导致的DIC有以下多个方面：促凝活性增强，纤维蛋白溶解的激活，肿瘤细胞溶解。

目前，已有多项AML中血栓与止血分子标志物的研究，在现有研究中，D-D和纤维蛋白原的临床预测能力最为突出，尽管研究结果参差不一。最近的研究发现，白血病细胞释放的核内蛋白，如组蛋白H3和HMGB1与肿瘤溶解相关DIC的发展之间可能存在联系；开始缓解诱导化疗后，血浆中这些血栓前核内蛋白水平增加，随后纤维蛋白降解产物(FDP)和D-D水平增加，并诊断为DIC[47]。样本量最大的研究报告了AML、骨髓瘤和淋巴瘤患者在基线期时D-D的高水平(>4.0 mg/L或>1.4 μg/mL)与VTE之间存在相关性，但在AML中D-D的升高高于正常上限几乎是普遍的，学界对于其成为预示不良预后的明确分界点没有共识[48]，分界点的确定有待于更多研究结果的出现。而当显性 DIC 出现时，提示完全失代偿阶段，难以治疗，常用于诊断DIC的ISTH评分可能不适用于AML疾病，因为它取决于PLT，而PLT受抗白血病治疗或输血的影响[36]，但其具有包含项目少，便于计算的优势[49]，在临床中亦存在价值。早期识别出凝血异常具有重要的临床意义，对AML患者出凝血异常具有特异性及敏感性的早期理想指标仍有待于发现。

综上所述，对于老年AML患者，早期诊断、分层治疗有助于控制病情发展，降低死亡率，改善远期预后。是否存在染色体突变有助于老年AML患者中医证型的诊断，WT1基因对判断老年AML患者临床预后具有一定价值，ISTH评分及D-D水平可协助诊断AML合并出凝血异常。