薇菜多糖的分离纯化及体外抗氧化活性

胡彦波，翟丽媛，刘 扬，赵偲如，赵 珺*

（长春大学食品科学与工程学院，吉林 长春 130022）

多糖是由10 个及以上单糖通过糖苷键连接而成的聚合物[1]，多存在于动植物和微生物体内，整体分为植物多糖、动物多糖和微生物多糖[2]。随着工业的飞速发展，多糖已应用于食品[3]、医药[4]和材料[5]等领域。研究发现，多糖具有免疫调节[6]、抗氧化[7]、抗肿瘤[8]和降低血糖活性[9]等多种功能。

薇菜学名紫萁（Osmunda japonicaThunb.），属于紫萁科紫萁属分株紫萁，是长白山地区常见的一种山野菜[10]。薇菜的主要营养成分包括多糖、黄酮、有机酸和蛋白质等，具有抗病毒、抗菌、驱虫、止血和抗炎镇痛等作用[11-12]。薇菜作为大宗山野菜，因其独特的生物活性被誉为“山菜之王”，远销日本和韩国等多个国家。薇菜多糖是一种结构复杂的糖类物质[13]，并且膳食纤维的含量在蕨菜、鱼腥草和菊苣等9 种野菜中最高[14]。研究表明薇菜多糖除了对机体的生长发育和代谢有重要作用外，还具有抗氧化、抗菌和抗肿瘤等功能[15-16]。近年来对薇菜多糖的研究有了初步进展，柯琼华等[17]利用水提醇沉法从薇菜干中提取薇菜多糖，经测定得到其单糖组成为甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸和葡萄糖等，经体外抗氧化反应测定薇菜多糖对2,2’-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸阳离子自由基具有良好的清除效果。Zhang Xueting等[18]利用薇菜多糖制备复合膜，有效提高了果蔬的保鲜效果，进一步证明薇菜多糖具有良好的抗氧化和抗菌活性。

目前对于薇菜多糖的系统分离纯化及结构分析研究较少，限制了薇菜多糖相关产品的开发与应用。因此，本实验对薇菜粗多糖进行分离纯化，并对其纯化后的组分进行成分分析和体外抗氧化活性的研究，以期为开发薇菜多糖功能性食品提供理论参考，同时，也为山野菜相关功能性食品的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

东北薇菜购自吉林省长白山露水河镇地区。

苯酚、硫酸、葡萄糖、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、VC、硫酸亚铁（FeSO4） 北京化工厂有限责任公司；二乙氨乙基（diethylaminoethyl，DEAE）-纤维素 上海源叶生物科技有限公司；氨基磺酸、半乳糖醛酸、间羟基联苯 范德（北京）生物科技有限公司；三氯乙酸天津市光复精细化工研究所；乙腈（色谱纯）、甲醇（色谱纯）、氯化钠（色谱纯） 北京化工厂有限责任公司；牛血清白蛋白 北京索莱宝科技有限公司；考马斯亮蓝 北京鼎国盛生物技术有限责任公司；溴化钾（KBr）（光谱纯） 天津市大茂化学试剂厂；1,1-二苯基-2-三硝基甲肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 上海麦克林生化科技有限公司；水杨酸天津市华东试剂厂；氯化硝基四氮唑蓝（nitrotetrazolium blue chloride，NBT）、还原型辅酶I（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）、吩嗪硫酸甲酯（phenazine methosulfate，PMS） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

UV-1901紫外-可见分光光度计 深圳亿鑫仪器设备有限公司；Nicolet iS 5傅里叶变换红外光谱仪 美国赛默飞世尔科技公司；3K15台式高速离心机、BM312-B旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；LC-10AT高效液相色谱仪 日本岛津公司。

1.3 方法

1.3.1 薇菜粗多糖的提取

采用水提醇沉法提取薇菜粗多糖。称取新鲜薇菜4 kg，用蒸馏水在料液比1∶20、提取时间4 h的条件下提取薇菜多糖。用旋转蒸发仪将多糖液浓缩至原体积的1/3，加入体积分数70%乙醇溶液过夜醇沉后，4 000 r/min离心20 min弃去上清液得到沉淀，在60 ℃水浴下不停地搅拌烘干，除去乙醇后，加蒸馏水（dH2O）溶解，冷冻干燥得到薇菜粗多糖（water soluble polysaccharide ofOsmunda japonica，WOJP），WOJP得率按公式（1）计算。

1.3.2 薇菜多糖的分离纯化

采用DEAE-纤维素对WOJP进行分离纯化。根据离子交换柱层析的原理，利用DEAE-纤维素经dH2O和NaCl分别洗脱后，制备不带电荷的中性糖和带电荷的酸性糖。称取WOJP粉末2 g，溶解于100 mL dH2O，离心后取上清液缓慢加到DEAE-纤维素层析柱中，待样品完全进入纤维素柱后，用dH2O压样两次，保证样品完全进入纤维素柱，随后用5 倍柱体积的dH2O洗脱中性糖，流速1.5 mL/min，收集洗脱液，即薇菜中性糖（neutral WOJP，WOJP-N）溶液。再用0～0.5 mol/L NaCl溶液进行梯度洗脱，流速2 mL/min，用自动收集器收集洗脱液，6.25 min收集一管。利用苯酚-硫酸法[19]在490 nm波长处测定收集液的吸光度，绘制洗脱曲线图，确定薇菜酸性糖（acidic WOJP，WOJP-A）梯度洗脱的盐离子浓度，根据洗脱曲线图可得到具有良好对称性的峰图，将该峰对应的洗脱液收集，即WOJP-A溶液。将WOJP-N溶液和WOJP-A溶液进行旋蒸浓缩和透析，最后冷冻干燥，得到WOJP-N和WOJP-A。

1.3.3 薇菜多糖的化学成分测定

1.3.3.1 糖质量分数的测定

采用苯酚-硫酸法[19]测定WOJP、WOJP-N和WOJP-A的糖质量分数。以葡萄糖为标准品，配制不同质量浓度的葡萄糖溶液，在490 nm波长处测定吸光度。以质量葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。将样品配制成质量浓度0.1 mg/mL的多糖溶液，取样600 μL，加400 μL的dH2O，其余步骤按照绘制标准曲线的操作步骤进行，做3 组平行实验。根据标准曲线方程计算样品中的糖质量分数。

1.3.3.2 糖醛酸质量分数的测定

采用间羟基联苯法[20]检测WOJP和WOJP-A的糖醛酸质量分数。以半乳糖醛酸为标准品；配制不同质量浓度的半乳糖醛酸溶液，在525 nm波长处测定吸光度。以半乳糖醛酸质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。将样品配制成质量浓度0.1 mg/mL的多糖溶液，取样400 μL，其余步骤按照绘制标准曲线的操作步骤进行，做3 组平行实验。根据标准曲线方程计算样品中的糖醛酸质量分数。

1.3.3.3 蛋白质量分数的测定

采用考马斯亮蓝法[21]检测WOJP、WOJP-N和WOJP-A的蛋白质量分数。以牛血清白蛋白为标准品；配制不同质量浓度的牛血清白蛋白溶液，在595 nm波长处测定吸光度。以牛血清白蛋白质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。将样品配制成质量浓度1 mg/mL的多糖溶液，取样400 μL，其余步骤按照绘制标准曲线的操作步骤进行，做3 组平行实验。根据标准曲线方程计算样品中的蛋白质量分数。

1.3.3.4 灰分质量分数的测定

采用马弗炉灼烧法[22]测定WOJP、WOJP-N和WOJP-A的灰分质量分数。灼烧坩埚8 h至其质量恒定后，称取待测多糖样品50 mg，精准至0.001 g，设置3 组平行实验，轻轻摇动振荡坩埚，使多糖样品在坩埚中均匀分布。打开马弗炉炉门，将坩埚置于炉膛内，马弗炉加热的温度设置为550 ℃，灼烧样品8 h，坩埚冷却至室温后称取质量。多糖样品灼烧至恒质量后，称量并计算多糖样品中的灰分质量分数。

1.3.4 薇菜多糖分子质量的测定

采用高效液相凝胶渗透色谱法（high performance gel permeation chromatography，HPGPC）[23]分析多糖的均一性和分子质量，高效液相色谱系统配备折射率检测器（refractive index detector，RID）和超水凝胶线性凝胶过滤色谱柱。称取1 mg多糖样品置于1.5 mL微型离心EP管中，加入200 μL超纯水（ddH2O），完全溶解多糖样品。0.22 μm无机相滤膜过滤，然后进行HPGPC检测。

HPGPC分析：采用Shimadzu HPLC系统（配有CTO-20A泵和RID-20折射率检测器），TSK-gel G-3000 PWXL色谱柱（7.8 mm×300 mm），流动相为NaCl（0.15 mol/L）-ddH2O，流速0.6 mL/min，进样量20 μL，检测波长245 nm。

1.3.5 薇菜多糖单糖组成测定

采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP）柱前衍生化和高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）检测分析单糖组成[24]。称取1 mg多糖样品置于酸水解小瓶中，加入1 mL的2 mol/L盐酸-甲醇溶液，充N2密封后，置于80 ℃金属浴中水解10 h后用空气泵吹干，再加入1 mL的2 mol/L三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）溶液，于120 ℃金属浴中水解1 h，用空气泵吹干除去TFA溶液。分别吸取100 μL质量浓度1 mg/mL的甘露糖（mannose，Man）、葡萄糖醛酸（glucuronic acid，GlcA）、鼠李糖（rhamnose monohydrate，Rha）、半乳糖醛酸（galacturonic acid，GalA）、葡萄糖（glucose，Glc）、半乳糖（galactose，Gal）、木糖（xylose，Xyl）、阿拉伯糖（arabinose，Ara）和岩藻糖（fucose，Fuc）标准品，得到标准品混合液，置于酸水解小瓶中备用。

向完全酸水解后得到的干燥样品和标准品中加入500 μL 0.3 mol/L NaOH溶液，使样品充分溶解，再加入500 μL的PMP-甲醇溶液，使其混合，取200 μL混合液于1.5 mL EP管中。将样品和标准品在70 ℃条件下水浴反应0.5 h，分别加入100 μL 0.3 mol/L HCl溶液，充分混匀后加入700 μL CH3Cl，充分振荡后，弃去CH3Cl层，保留水层，重复操作萃取3 次。0.22 μm有机相滤膜过滤，然后进行HPLC检测。

HPLC分析：采用HPLC系统（配有CTO-20A泵和SPD-20AVD紫外光检测器），DIKMA Inertsil ODS-3色谱柱（4.6 mm×150 mm），流动相为磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）（0.2 mol/L、pH 7.0）-乙腈（81∶19，V/V），流速1 mL/min，进样量20 μL，检测波长245 nm。

1.3.6 傅里叶变换红外光谱分析

将1 mg样品粉末和180 mg KBr混合研磨，压片机压片。样品测试前进行背景扫描去除干扰，在4 000～500 cm-1的条件下，测定多糖的有机官能团[25]。

1.3.7 薇菜多糖抗氧化活性的测定

考虑到结果的全面性，将样品质量浓度分别设定为0.5、1、2、5 mg/mL和10 mg/mL[26]，以期得到较完整的实验结果，达到分析薇菜多糖体外抗氧化活性的目的。

1.3.7.1 还原力测定

还原力的测定根据文献[27]稍作修改，配制5 个质量浓度梯度的多糖样品溶液，分别取1 mL样品溶液，加入2.5 mL 0.2 mol/L pH 6.6的PBS和2.5 mL 体积分数1%铁氰化钾溶液混合，于50 ℃下恒温水浴20 min，迅速冰浴冷却，加入1 mL的体积分数10%三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）溶液混合均匀后8 000 r/min离心5 min，取1.5 mL上清液加入1.5 mL dH2O、1.5 mL体积分数0.1%的FeCl3溶液混匀，静置10 min，在700 nm波长处测定吸光度，以VC为阳性对照，每个样品测定3 次取其平均值，通过比较样品和VC的吸光度，判断多糖的还原能力。

1.3.7.2 DPPH自由基清除能力测定

DPPH自由基清除率的测定根据文献[28]稍作修改。分别取0.6 mL不同质量浓度的多糖样品溶液和2.4 mL 0.1 mmol/L DPPH溶液混合均匀，避光反应30 min后，在517 nm波长处测定混合溶液的吸光度A1，同时测定用dH2O作空白对照的吸光度A0以及无水乙醇代替DPPH溶液作对照的吸光度A2，以VC为阳性对照，每个样品测定3 次取其平均值，按公式（2）计算DPPH自由基清除率。

式中：A0为0.6 mL dH2O+2.4 mL DPPH的吸光度；A1为0.6 mL样品溶液+2.4 mL DPPH的吸光度；A2为0.6 mL样品溶液+2.4 mL无水乙醇的吸光度。

1.3.7.3 羟自由基清除能力测定

羟自由基清除率的测定根据文献[29]稍作修改，分别取500 μL不同质量浓度的样品溶液与1 mL FeSO4、1 mL水杨酸、1 mL过氧化氢（H2O2）混合，25 ℃室温下静置避光反应30 min，测定其在510 nm波长处的吸光度A1，以dH2O代替H2O2测得吸光度A2，以dH2O代替样品测得吸光度A0，以VC为阳性对照。每个样品测定3 次取其平均值，按公式（3）计算羟自由基清除率。

式中：A0为500 μL dH2O+1 mL水杨酸+1 mL H2O2的吸光度；A1为500 μL样品溶液+1 mL水杨酸+1 mL H2O2的吸光度；A2为500 μL样品溶液+1 mL水杨酸+1 mL dH2O的吸光度。

1.3.7.4 超氧阴离子自由基清除能力测定

超氧阴离子自由基清除率的测定根据文献[30]稍作修改，分别取50 μL不同质量浓度的样品溶液与50 μL 300 μmol/L NBT、50 μL 936 μmol/L NADH、50 μL 120 μmol/L PMS混合均匀后，避光反应30 min，测定其在570 nm波长处的吸光度A1，以dH2O代替样品测得吸光度A0，以dH2O代替PMS测得吸光度A2，以VC为阳性对照。每个样品测定3 次取其平均值，超氧阴离子自由基清除率按公式（4）计算。

式中：A0为50 μL dH2O+50 μL NBT+50 μL NADH+50 μL PMS的吸光度；A1为50 μL样品溶液+50 μL NBT+50 μL NADH+50 μL PMS的吸光度；A2为50 μL样品溶液+50 μL NBT+50 μL NADH+50 μL dH2O的吸光度。

1.4 数据处理与分析

所有实验均重复3 次，结果表示为平均值±标准偏差，使用SPSS 24.0数据处理软件对数据进行分析，采用多重比较法进行显著性分析（以P＜0.05表示差异显著），使用Origin 2018软件作图。

2 结果与分析

2.1 薇菜多糖的分离纯化

2.1.1 阴离子交换柱层析法分离纯化薇菜多糖

通过水提醇沉法对薇菜粗多糖WOJP进行提取，测定WOJP的得率为9.3%。进一步利用阴离子交换柱层析法对WOJP进行分离纯化，薇菜多糖的梯度洗脱结果如图1所示。薇菜粗多糖经过分离纯化得到2 个多糖组分，分别为dH2O洗脱获得的中性糖WOJP-N和0.2 mol/L NaCl洗脱获得的酸性糖WOJP-A。收集样品，浓缩、透析、冻干后分别得到棕色和白色粉末。进一步测定WOJP-N的得率为23.4%，WOJP-A的得率为26.3%。WOJP-N和WOJP-A的得率均在25%左右，作为WOJP的主要组成成分，两者均具有一定的研究应用价值，因此对两者进行进一步的分析测定。

图1 薇菜多糖的梯度洗脱图Fig.1 Gradient elution curve of polysaccharides from Osmunda japonica

2.1.2 薇菜多糖的化学成分分析结果

对WOJP、WOJP-N和WOJP-A的化学成分进行分析，结果如表1所示，WOJP、WOJP-N和WOJP-A的糖质量分数分别为73.2%、38.5%和49.0%，WOJP-A的糖质量分数高于WOJP-N，说明在薇菜多糖组分中，酸性糖中的可溶性多糖含量高于中性糖。WOJP和WOJP-A的糖醛酸含量差异不明显，质量分数均在68%左右，说明薇菜多糖中的糖醛酸含量集中于酸性糖组分中，中性糖中含有微量或几乎没有游离糖醛酸成分。WOJP-N和WOJP-A的蛋白质量分数明显低于WOJP，鉴于接下来的抗氧化实验主要研究薇菜多糖不同组分体外抗氧化活性之间的关系，蛋白质的存在对实验结果的影响不起决定性因素，因此，不进行进一步的脱蛋白处理。WOJP、WOJP-N和WOJP-A的灰分质量分数略高，证明薇菜多糖中含有少量无机盐等杂质。

表1 薇菜多糖的化学成分分析Table 1 Chemical composition analysis of polysaccharides from Osmunda japonica

2.2 薇菜多糖的分子质量分析结果

采用HPGPC测定WOJP-N和WOJP-A的分子质量。由图2可知，两种多糖的色谱图均主要存在一个明显的特征峰，经过计算可知，WOJP-N的主要分子质量分布在31.8 kDa左右，WOJP-A则主要分布在15.7 kDa左右。但同时二者均存在若干响应值较低的杂峰，说明WOJP-N和WOJP-A均不是均一多糖。

图2 WOJP-N和WOJP-A的高效凝胶渗透色谱Fig.2 Determination of molecular mass of WOJP-N and WOJP-A by high performance gel permeation chromatography

2.3 薇菜多糖的单糖组成分析结果

进一步通过HPLC测定薇菜多糖的单糖组成，以9 种单糖标准品为对照，结果表明，WOJP、WOJP-N和WOJP-A的单糖组成存在明显差异。经过计算各单糖的物质的量比，结果如表2所示，WOJP中的主要单糖组分及其物质的量比是GalA∶Glc∶Gal∶Ara＝41.0∶15.5∶23.7∶5.8；WOJP-N中的主要单糖组分及其物质的量比是Rha∶GalA∶Glc∶Gal∶Xyl∶Ara＝9.1∶5.7∶13.3∶37.6∶5.6∶11.8；WOJP-A中的主要单糖组分及其物质的量比是Rha∶GalA∶Gal∶Ara＝7.0∶56.4∶26.1∶5.2。分析各单糖组成的结果可知，WOJP主要由GalA、Glc和Gal组成；WOJP-N主要由Glc、Gal和Ara组成，推测其可能由阿拉伯半乳聚糖（arabinogalactan，AG）型果胶（主要含有β-Galp和α-Araf）和葡聚糖组成[31]；而WOJP-A的组成成分中则主要含有GalA和Gal，推测其可能由半乳糖醛酸聚糖（homogalacturonan，HG）型果胶（主要含有α-1,4-GalpA）和半乳聚糖（主要含有β-Galp）组成[32]。

表2 薇菜多糖的单糖组成Table 2 Monosaccharide composition of polysaccharides from Osmunda japonica

2.4 傅里叶变换红外光谱分析结果

利用傅里叶变换红外光谱对薇菜多糖进行分析，如图3所示，WOJP、WOJP-N和WOJP-A在3 400 cm-1附近的吸收峰为多糖O—H伸缩振动特征峰；在2 930 cm-1附近的吸收峰为多糖类物质C—H伸缩振动所产生，这是糖类物质的两个特征吸收峰[33]；进一步分析发现，WOJP-A在1 740 cm-1处具有明显的酯化糖醛酸特征吸收峰，且在1 410 cm-1附近处有COO—对称伸缩振动吸收峰[34]，说明WOJP-A中含有较多的糖醛酸，且存在部分酯化修饰；此外，还可以观察到WOJP和WOJP-A在1 100 cm-1和1 020 cm-1附近具有C—O—C和C—O—H中C—O的伸缩振动吸收峰，是吡喃环的特征吸收峰[35]，说明WOJP和WOJP-A均含有吡喃糖环，其中WOJP-A含量最多；在890 cm-1附近的吸收峰可以归属于β-糖苷键的振动[36]，表明WOJP-N中主要含有β-糖苷键。结合单糖组成分析结果可以推断：WOJP-N主要由β-构型的半乳糖组成，WOJP-A主要由吡喃半乳糖醛酸组成，且存在部分酯化修饰。

图3 薇菜多糖的傅里叶变换红外光谱Fig.3 FTIR spectra of polysaccharides from Osmunda japonica

2.5 薇菜多糖的体外抗氧化活性

2.5.1 还原能力分析结果

薇菜多糖对Fe3+的还原能力实验结果如图4所示。随着薇菜多糖质量浓度增加，Fe3+还原力均呈上升趋势。在相同质量浓度下，WOJP对Fe3+的还原力明显高于WOJP-N和WOJP-A，其中WOJP-A对Fe3+的还原力最弱。研究表明，多糖的还原能力是其判断抗氧化活性的一个重要指标，其抗氧化活性与单糖组成密切相关[37-38]。与WOJP-A相比，WOJP和WOJP-N单糖组成中Glc的含量相近，且高于WOJP-A中Glc的含量；同时，WOJP-A中GalA的含量明显高于WOJP-N，略高于WOJP。这几种糖组成的差异可能是导致WOJP和WOJP-N还原Fe3+能力相当，且高于WOJP-A的主要原因。此外，当质量浓度达到10 mg/mL时，WOJP-N对Fe3+还原力与VC相当，而WOJP在质量浓度为5 mg/mL时对Fe3+的还原力已经与VC相当。因此，在进行WOJP的还原能力分析时可将样品质量浓度控制在5 mg/mL，以达到节省样品的目的。结果表明WOJP对Fe3+的还原能力的主要活性多糖组分为WOJP-N。

图4 不同质量浓度薇菜多糖的Fe3＋还原能力Fig.4 Fe3+-reducing power of polysaccharides from Osmunda japonica

2.5.2 DPPH自由基清除能力分析结果

薇菜多糖对DPPH自由基的清除能力实验结果如图5所示。薇菜多糖是多羟基化合物，具有很强的还原性，极易与DPPH发生氧化反应生成醌类物质。当多糖质量浓度从0.5 mg/mL增加到10 mg/mL时，WOJP的DPPH自由基清除能力逐渐增强。在10 mg/mL下，WOJP对DPPH自由基的清除能力达到100%，与VC的清除能力相当。WOJP-A随着质量浓度的提高，其DPPH自由基清除能力增强。在10 mg/mL下，WOJP-A的DPPH自由基清除率为72.46%。WOJP-N的DPPH自由基清除能力从2 mg/mL提高到10 mg/mL，清除能力增长较为缓慢。而在10 mg/mL浓度下，WOJP-N的DPPH清除率为86.39%，其清除率接近WOJP。由此可以推断，对于薇菜多糖的DPPH自由基清除能力，WOJP-N为主要活性多糖组分。与冬枣多糖[38]、茶粕多糖[39]和刺五加果多糖[40]等多数植物多糖相比，薇菜多糖具有较强的清除DPPH自由基能力，可作为新型的天然抗氧化剂。

图5 不同质量浓度薇菜多糖的DPPH自由基清除能力Fig.5 DPPH radical-scavenging capacity of polysaccharides from Osmunda japonica

2.5.3 羟自由基清除能力分析结果

通过测定薇菜多糖对羟自由基的清除能力，分析薇菜多糖的抗氧化活性，结果如图6所示。薇菜多糖对羟自由基具有一定的清除能力。随着质量浓度的增加，薇菜多糖清除羟自由基的能力也逐渐增强。当质量浓度为10 mg/mL时，WOJP的羟自由基清除能力为75.50%，WOJP-A的羟自由基清除能力为73.60%，而WOJP-N的羟自由基清除能力为49.17%，说明WOJP和WOJP-A的羟自由基清除能力相当且强于WOJP-N。研究表明多糖清除羟自由基的机制可能是通过糖醛酸与亚铁离子耦合，从而抑制羟自由基的产生[41-42]。由于WOJP-A和WOJP中半乳糖醛酸含量较高，即含有的糖醛酸较高，而WOJP-N中含有的糖醛酸极低，因此，WOJP中清除羟自由基的主要活性多糖组分为WOJP-A。

图6 不同质量浓度薇菜多糖的羟自由基清除能力Fig.6 Hydroxyl radical-scavenging capacity of polysaccharides from Osmunda sinensis

2.5.4 超氧阴离子自由基清除能力分析结果

通过测定薇菜多糖清除超氧阴离子自由基的能力，分析薇菜多糖的抗氧化活性，结果如图7所示。随着质量浓度的增加，WOJP和WOJP-N清除超氧阴离子自由基的能力增强显著（P＜0.05），呈现明显的质量浓度依赖性，而WOJP-A对质量浓度的依赖性较低。此外，随着质量浓度的升高，WOJP和WOJP-N的清除超氧阴离子自由基的能力相当，且均高于WOJP-A，当质量浓度达到10 mg/mL时，WOJP的超氧阴离子自由基清除率为91.09%，WOJP-N的超氧阴离子自由基清除率为93.59%，而WOJP-A的超氧阴离子清除率为61.05%。由此可以推断，WOJP清除超氧阴离子自由基的主要活性多糖组分为WOJP-N。研究表明，不同分子质量、糖苷键类型以及单糖组成的多糖清除超氧阴离子自由基能力不同，其中含有β-糖苷键的多糖清除自由基能力较强[43-44]。比较WOJP-N和WOJP-A中糖苷键的构型可知，WOJP-N中含有较多的β-糖苷键，这可能是导致WOJP-N具有较高清除超氧阴离子自由基能力的主要原因。

图7 不同质量浓度薇菜多糖的超氧阴离子自由基清除能力Fig.7 Superoxide anion radical-scavenging capacity of polysaccharides from Osmunda japonica

综上所述，根据薇菜多糖的4 种体外抗氧化实验结果可知：WOJP-N和WOJP-A在清除自由基以及还原Fe3+能力方面表现出不同活性。其中WOJP-N清除DPPH自由基和超氧阴离子自由基的能力以及还原Fe3+的能力与WOJP基本相当，而WOJP-A相对较弱；WOJP-A清除羟自由基的能力与WOJP基本相当，而WOJP-N相对较弱。在4 种体外抗氧化活性中，WOJP均表现出较好的活性，其主要原因是两者在WOJP的体外抗氧化活性中起协同作用，从而使WOJP发挥抗氧化作用。因此，WOJP-N和WOJP-A均是WOJP抗氧化能力的主要活性组分。

3 结 论

本实验通过水提醇沉技术对薇菜多糖进行提取，利用DEAE-纤维素离子交换柱层析对其进行分离纯化，获得2 种多糖组分WOJP-N和WOJP-A，并对其组成成分和体外抗氧化活性进行了分析。结果表明，WOJP-N和WOJP-A的分子质量分别为31.8 kDa和15.7 kDa，化学成分分析表明2 种多糖存在一定差异，傅里叶变换红外光谱测定发现WOJP-N主要由β-构型的半乳糖组成，WOJP-A主要由吡喃半乳糖醛酸组成，且存在部分酯化修饰。4 种体外抗氧化实验结果表明，WOJP具有很好的抗氧化活性，其抗氧化活性与VC相当。进一步明确了在WOJP发挥抗氧化活性时，WOJP-N和WOJP-A具有协同作用。上述研究结果可为薇菜多糖的应用提供理论依据，对薇菜综合开发利用具有一定意义。