乙烯利处理‘赤霞珠’葡萄果实对其葡萄酒中酚类物质组分的影响

刘美迎，姜军生，姜乃春，邢迎东，张振文,3,*

（1.潍坊学院，山东 潍坊 261061；2.西北农林科技大学葡萄酒学院，陕西 杨凌 712100；3.陕西省葡萄与葡萄酒工程中心，陕西 杨凌 712100）

酚类物质是酿酒葡萄的主要次生代谢产物之一，主要分布在葡萄果皮和种子中，其含量和组成受葡萄品种、果实成熟度、栽培措施、气候、土壤酿酒工艺等多方面因素影响[1-4]。葡萄酒中的酚类物质通过浸渍作用由葡萄果实进入葡萄酒中，其含量和比例对葡萄酒的颜色、收敛性、澄清度和稳定性等品质有着重要的作用[5]。葡萄酒中的酚类物质可被分为花色苷和非花色苷两大类，其中花色苷类物质包括花翠素、花青素、甲基花翠素、甲基花青素、二甲花翠素及其衍生物等，而非花色苷类酚类物质主要包括黄酮醇类、黄烷醇类、酚酸类及白藜芦醇等一些特殊的芪类物质。酚类物质是葡萄酒保健功效的重要组成物质，葡萄酒中的多酚物质能够清除人体内自由基，降低心脑血管疾病的发生率，具有抗氧化、抗衰老的功效[6-8]。

乙烯作为五大类植物激素之一，其在植物整个生长发育过程中参与种子的萌发，抑制茎和根的伸长，促进果实的成熟、脱落和衰老进程等生理过程[9]。葡萄果实由于其成熟发育过程中没有显著的呼吸跃变和大量乙烯的合成，因而被普遍认定为非呼吸跃变型果实[10]。但近年来众多研究结果表明，乙烯对于葡萄果实的成熟和花色苷的积累具有重要作用[11-13]。前人研究发现葡萄果实在转色前其内源乙烯的含量显著增加[11]，外源乙烯处理能诱导葡萄果实内源乙烯含量的增加，促进果实着色，上调花色苷合成基因的表达，进而促进花色苷含量的增加[14]。本课题组前期研究结果也表明，外源乙烯利能显著提高葡萄果皮中总酚、总类黄酮、花色苷和原花色素的含量，并促进VvUFGT、VvMYBA1等花色苷合成基因及VvLAR、VvANR和VvMYBPA1等原花色素合成基因的上调表达[15]。

乙烯能够调控葡萄果实酚类物质合成方面的研究已取得一定进展，但在酿酒葡萄栽培技术中采用田间应用外源乙烯利处理葡萄果实对相应葡萄酒的品质，特别是对葡萄酒中酚类物质单体组分、含量和比例等方面影响的研究尚不充分。本研究以欧亚种葡萄品种‘赤霞珠’为试材，研究田间应用外源乙烯利处理酿酒葡萄果实后对相应葡萄酒中酚类物质的种类、含量和组分的影响，以期更系统地阐明乙烯对葡萄酒品质，特别是对葡萄酒酚类物质组成方面的影响，为构建完善的植物激素乙烯与葡萄和葡萄酒酚类物质次生代谢成分之间的网络关系提供一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验用地概况、材料与试剂

本实验在陕西省泾阳县瓦窑沟村（34°65′ N、108°75′ E）葡萄园进行，地形为丘陵半丘陵，属暖温带大陆性季风气候，年平均气温13 ℃，年平均降水量548.7 mm，年平均日照时长2 195.2 h，无霜期年平均213 d。

本实验选用品种为2009年定植的欧亚种（Vitis viniferaL.）酿酒葡萄‘赤霞珠’（Cabernet Sauvignon），自根苗，灌溉方式为滴灌。所有树形均为单干双臂整形，篱架，主干高50 cm，东西行向栽培，株行距0.8 m×2.5 m。短梢修剪，果穗数为每新梢1～2 穗。

乙烯利 上海生工生物工程公司；LALLZYMREX果胶酶 法国Lallemand公司；RC212酿酒酵母法国Lavlin公司；花色苷标准品（花翠素-3-O-葡萄糖苷、花青素-3-O-葡萄糖苷、甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷、甲基花青素-3-O-葡萄糖苷、二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷）、黄烷醇标准品（原花色素B1、原花色素B2、原花色素C1、儿茶素、表儿茶素、表棓儿茶素）、黄酮醇标准品（槲皮素及其衍生物、杨梅酮类及其衍生物、山柰酚及其衍生物等）、酚酸类标准品（没食子酸、原儿茶酸、香草酸、水杨酸、香豆酸、阿魏酸、绿原酸、咖啡酸）美国Sigma-Aldrich公司；甲醇、甲酸、乙腈（均为色谱纯）美国Fisher公司；甲醇、甲酸、丙酮、乙酸钠（均为分析纯） 北京化学试剂公司。

1.2 仪器与设备

AUW220D电子天平 日本岛津公司；PAL-1型手持折射计 日本爱拓公司；冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司；超声提取器 昆山市超声仪器有限公司；5804R低温冷冻离心机 德国Eppendorf公司；R206旋转蒸发仪 上海申生科技有限公司；SHZ-III型循环水式真空泵 上海亚荣生化仪器厂；1100系列LC/MSD Trap-VL高效液相色谱-离子阱质谱联用仪（配备G1379A真空溶剂脱气机、G1312B二元高压梯度泵、G1313A自动进样器、G1316A柱温箱、G1315A二极管阵列检测器和Zorbax Eclipse SB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm））、1200系列LC/MSD高效液相色谱-离子阱质谱联用仪（配备G1379A真空溶剂脱气机、G1311A四元高压梯度泵、G1313A自动进样器、G1316A柱温箱、G1315A二极管阵列检测器和ZORBAX SB-C18色谱柱（3 mm×50 mm，1.8 μm）） 美国安捷伦科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 实验处理与分组

实验于2013年进行。在果实转色初期（每穗葡萄果实上有5%～10%的果粒出现转色），用400 mg/L的乙烯利（含1 mL/L Tween-80）（ET处理组）或1 mL/L的Tween-80（对照组）浸蘸果穗20 s。处理组和对照组均分别选取连续3 行葡萄植株作为每组的3 个生物学重复，每个生物学重复中包含20 株随机选取的长势一致的健康葡萄植株用于实验。本实验供试材料树体为东西行向，为保证处理组和对照组的葡萄果实样本受光照程度一致，均选定树体南向的果穗进行标记并处理。

根据果实含糖量确定样品的最终采收期。在接近采收一周前持续利用PAL-1型手持折射计对挤压获得的果汁进行可溶性固形物含量测定，当测量值达到22 °Brix以上且持续3 d不再变化时对样品进行采收，采收时按照处理的生物学重复分别采收葡萄并进行单品种的小容器酿造。

小容器酿造参考Jiang Bao等[16]的方法。每个处理选取20 kg左右葡萄原料，剔除烂果青果，手动除梗破碎后，将葡萄果实转入20 L玻璃发酵罐中，添加亚硫酸至二氧化硫终质量浓度为60 mg/L，同时添加果胶酶至终质量浓度为30 mg/L并搅拌均匀。浸渍24 h后，加入充分活化的酿酒酵母至终质量浓度为200 mg/L。随后控制在18～25 ℃的环境下进行酒精发酵，每天两次监测并记录比重及温度，同时在每次监测后对葡萄醪进行搅拌以充分浸渍皮渣。整个发酵过程持续10 d左右，当比重达到0.993～0.996之间并连续2 d不再变化时，酒精发酵结束，随后将酒液与皮渣分离并加入终质量浓度为50 mg/L的亚硫酸。静置15 d后去除酒泥，并将葡萄酒装瓶置于10～15 ℃陈酿12 个月。

1.3.2 葡萄酒指标测定

1.3.2.1 基本理化指标测定

葡萄酒基本理化组分（酒精度、残糖质量浓度、可滴定酸质量浓度、pH值、挥发酸质量浓度）测定参考GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》进行。

葡萄酒的色度色调采用CIE Lab法测定[17]。具体流程为酒样过0.45 μm有机滤膜后测其pH值，然后用与葡萄酒相同pH值磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液稀释10 倍，以蒸馏水为对照，在紫外-可见分光光度计下，通过2 mm光径比色皿分别检测450、520、570、630 nm 4 个波长处的吸光度，并计算L值、C值、a值和b值。其中，L值表示色泽明亮度，与葡萄酒酒体颜色的深浅成反比；C值表示色饱和度，C值越高说明葡萄酒颜色的饱和度越高；a值表示红色（正值）和绿色（负值）程度；b值表示黄色（正值）和蓝色（负值）程度。

1.3.2.2 酚类物质的测定

首先取2 mL待测酒样，离心，经过0.45 μm的无机滤膜过滤后上机，采用高效液相色谱-质谱技术进行测定。

花色苷的测定：采用1100系列LC/MSD Trap-VL高效液相色谱-离子阱质谱联用仪（配有二极管阵列检测器）进行样品的定性和定量分析。色谱条件：流动相A：V（甲酸）∶V（乙腈）∶V（去离子水）＝2∶6∶92，流动相B：V（甲酸）∶V（乙腈）∶V（去离子水）＝2∶54∶44。流动相洗脱程序：1～18 min，10%～25% B；18～20 min，25% B；20～30 min，25%～40% B；30～35 min，40%～70% B；35～40 min，70%～100% B。流动相流速为1.0 mL/min；柱温为50 ℃；检测波长为525 nm；波长扫描范围200～900 nm；进样量为30 μL。质谱条件：电喷雾离子源（electron spray ionization，ESI），正离子模式。离子扫描范围为100～1 500m/z；雾化器压力为35 psi；干燥气流速为12 L/min；干燥气温度为300 ℃。所有样品均重复检测3 次。

非花色苷的测定：采用1200系列LC/MSD高效液相色谱-离子阱质谱联用仪。色谱条件：流动相A为体积分数1%乙酸溶液，流动相B为含体积分数1%乙酸的乙腈溶液。洗脱程序：0～5 min，5%～8% B；5～7 min，8%～12% B；7～12 min，12%～18% B；12.00～17.00 min，18%～22% B；17～19 min，22%～35% B；19～21 min，35%～100% B；21～25 min，100% B；25～27 min，100%～5% B。流速：1.0 mL/min；柱温：25 ℃；检测波长：280 nm；波长扫描范围：200～900 nm；进样量：2 μL。ESI参数设置：负离子模式，雾化器压力为35 psi；干燥器流速为10 L/min；干燥器温度为325 ℃；诱导碰撞解离（collision-induced dissociation，CID）的MS/MS诱导碰撞电压为1.00 V；离子扫描范围为100～1 500m/z。所有样品均重复检测3 次。

1.3.2.3 酚类物质的定性和定量

花色苷酚类物质的定性：参照中国农业大学葡萄与葡萄酒研究中心建立的“葡萄与葡萄酒酒花色苷HPLCUV-MS指纹谱库”，结合保留时间对样品中的花色苷单体物质进行定性。

非花色苷酚类物质的定性：通过对比标准品的洗脱顺序和保留时间，对照分子离子和碎片离子质量并参考文献[18]来确定物质的种类。

花色苷和非花色苷酚类物质的定量均采用外标法，以酚类物质单体标准品为外标物，建立5～500 mg/L之间、9 个水平、3 个重复的标准曲线（R2＞0.999）。实验样品中各酚类物质单体的质量浓度通过标准曲线计算，单位为mg/L。除已有标准品的花色苷单体外，检测出的其他花色苷类衍生物均以其对应的非修饰花色苷单体的面积比计算其质量浓度。

1.4 数据统计与分析

使用Excel 2010和SPSS 16.0分析软件进行数据处理及显著性差异T检验；利用Rstudio软件中的matrix计算相关性矩阵，并采用Corrplot程序包绘制相关性热力图；利用MetaboAnalyst 3.0网页版（http://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/home.xhtml）进行偏最小二乘法判别分析（partial least squares discriminant analysis，PLSDA）[19]；采用Origin 8.0软件绘制柱状图。

2 结果与分析

2.1 两个处理间成熟期葡萄果实和葡萄酒酒样基本指标和色度色调比较

葡萄酒的基本理化组成包括葡萄酒的酒精度、pH值及残糖、挥发酸、可滴定酸质量浓度。本研究中两个样品葡萄酒的基本理化指标如表1所示，结果显示两处理组间残糖质量浓度、pH值及可滴定酸质量浓度之间差异不显著，但乙烯利处理的葡萄酒的酒精度和挥发酸质量浓度分别显著高于和低于对照组，这也进一步表明在酿造葡萄酒之前，乙烯利处理的葡萄果实原料的成熟度高于对照组。

表1 两个处理间酒样基本指标和色度色调比较Table 1 Comparison of physicochemical characteristics of two different wine samples

与对照组相比，乙烯利处理组葡萄酒的红-绿色调（a值）、黄-蓝色调（b值）和色度值（C值）更高，即经过乙烯利处理的葡萄酒呈现出更加偏向红色和黄色的色调，且饱和度更高。而乙烯利处理组葡萄酒亮度（L值）低于对照组，表明乙烯利处理组葡萄酒样品的明亮度偏低，即颜色比对照组葡萄酒样品更深。

采收期葡萄果实的基本指标测定结果如表2所示，乙烯利处理对采收期葡萄果实的单果质量、果粒大小（粒径）、pH值及还原糖的质量浓度没有显著影响，但能显著地促进果实可溶性固形物含量的提高，并显著降低果实的可滴定酸质量浓度，且乙烯利处理组的葡萄果实糖酸比也显著高于对照组。由此可见，外源乙烯利处理可以提高葡萄果实的成熟度。

表2 两个处理间采收期葡萄果实基本理化指标Table 2 Physicochemical characteristics of harvested grapes with and without ET treatment

2.2 外源乙烯利对赤霞珠葡萄酒花色苷的影响

花色苷酚类物质是葡萄与葡萄酒中一类重要的呈色物质，能赋予红葡萄酒鲜艳的颜色，在葡萄酒的抗氧化能力和抗菌、消炎、保健功能等方面具有积极作用[20]。本研究中两组样品的葡萄酒中共检测到30 种花色苷物质，包括花翠素、花青素、甲基花翠素、甲基花青素和二甲花翠素的单糖苷及其酰基化衍生物。由表3可见，在不同的花色苷单体中以二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷的质量浓度最高，其次为二甲花翠素-3-O-(6-O-乙酰化)葡萄糖苷、甲基花翠素-3-O-(6-O-乙酰化)葡萄糖苷、甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷和二甲花翠素-3-O-(6-O-反式香豆酰化)葡萄糖苷，其余形式的花色苷质量浓度均较低。不同样品间比较发现，乙烯利处理组葡萄酒样品的花色苷总质量浓度为236.57 mg/L，显著高于对照组样品（171.78 mg/L）。不同类型的单体花色苷中，除二甲花翠素、甲基花青素、甲基花翠素的反式香豆酰化的花色苷单体（A3、A9、A15）和花青素、花翠素的乙酰化及反式香豆酰化花色苷（A20、A21、A26、A27）质量浓度在两样品间差异不显著外，其余花色苷单体均表现为乙烯利处理组显著高于对照组。同时，4-丙酮酸花青素-3-O-葡萄糖苷（A22）和4-丙酮酸花青素-3-O-乙酰化葡萄糖苷（A23）两类吡喃型花色苷在两组葡萄酒样品中的检测结果均为痕量。综上，乙烯利处理可以提高葡萄酒中大部分单体花色苷质量浓度及花色苷的总质量浓度。

表3 外源乙烯利对‘赤霞珠’葡萄酒花色苷酚类物质的影响Table 3 Effect of exogenous ethophen on the concentrations of individual anthocyanin phenolics in ‘Cabernet Sauvignon’ wine

2.3 外源乙烯利对赤霞珠葡萄酒非花色苷酚的影响

葡萄酒中的非花色苷酚类物质主要包括黄酮醇类、黄烷-3-醇类、羟基苯甲酸类、羟基肉桂酸酚酸类及白藜芦醇等芪类物质，对葡萄酒的颜色、苦味、收敛性、澄清度和抗氧化性等方面发挥着重要作用[21]。本研究从两个赤霞珠葡萄酒样品中共检测到26 种非花色苷酚单体物质，结果如表4所示，两种葡萄酒样品中的非花色苷酚类物质以儿茶素、表儿茶素和没食子酸为主，其次是原花色素B1、原花色素B2等黄烷醇类物质。样本间比较结果显示，对照组和乙烯利处理组的葡萄酒样品中的非花色苷酚类物质总质量浓度分别为97.92 mg/L和105.56 mg/L，乙烯处理组显著高于对照处理组（P＜0.05）。不同类型的单体非花色苷酚中，表儿茶素、原花色素B1、原花色素C1、杨梅酮-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖酸、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、异鼠李亭-3-O-葡萄糖苷、丁香亭-3-O-葡萄糖苷、没食子酸和香草酸的质量浓度均表现为乙烯利处理组显著高于对照组。可见，乙烯利处理可以提高葡萄酒中的大部分单体非花色苷酚物质质量浓度及非花色苷酚的总质量浓度。

表4 外源乙烯利对‘赤霞珠’葡萄酒非花色苷酚类物质的影响Table 4 Effect of exogenous ethophen on the concentrations of individual non-anthocyanin phenolics in ‘Cabernet Sauvignon’ wine

2.4 各酚类物质单体间的相关性分析结果

利用Rstudio软件绘制酚类物质单体质量浓度间的相关性热力分析图，如图1所示。I组中的各单体质量浓度两两之间具有明显的正相关关系，II组中的各酚类物质单体除花青素-3-O-(6-O-乙酰化)葡萄糖苷（A20）、花青素-3-O-(6-O-反式香豆酰化)葡萄糖苷（A21）、水杨酸（NA21）外，彼此间质量浓度也呈显著的正相关关系，但其与I组中的酚类物质间则呈现出显著或极显著的负相关性，表明I组与II组中的各酚类物质均受到乙烯利处理的影响，但其影响效果不同。同时，在各花色苷单体中，花色苷总质量浓度（A31）与二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷（A1）、二甲花翠素-3-O-(6-O-乙酰化)葡萄糖苷（A2）质量浓度的正相关系数最高；在非花色苷单体中，非花色苷物质总质量浓度（NA27）与没食子酸质量浓度（NA17）的正相关系数最高，同时花色苷总质量浓度（A31）和非花色苷物质总质量浓度（NA27）间也具有显著的正相关关系，说明乙烯利处理对葡萄酒中花色苷的总质量浓度和非花色苷的总质量浓度的影响效果一致，且该影响效果分别与二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷（A1）、二甲花翠素-3-O-(6-O-乙酰化)葡萄糖苷（A2）类花色苷单体和没食子酸类非花色苷单体物质的变化相关。此外，花青素-3-O-(6-O-乙酰化)葡萄糖苷（A20）、花青素-3-O-(6-O-反式香豆酰化)葡萄糖苷（A21）、水杨酸（NA21）与其他单体物质质量浓度间均没有明显的相关性，说明葡萄酒中上述3 种物质的质量浓度变化不受乙烯利处理的影响。

2.5 样品间各酚类物质单体的差异倍数变化分析结果

为了更大程度地呈现乙烯利处理对单一酚类物质单体的影响效果，将两组数据的同一种酚类物质质量浓度进行差异倍数（fold change，FC）的计算（处理组酚类物质质量浓度与对照组酚类物质质量浓度之比），结果如图2所示。图中纵坐标log2FC代表差异倍数的对数，且纵坐标的正半轴表示处理组与对照组的差异倍数为正值，乙烯利处理效果为正向影响；反之，纵坐标的负半轴表示处理组与对照组的差异倍数为负值，乙烯利处理效果则为负向影响。横坐标代表不同的酚类物质，其中4-丙酮酸花青素-3-O-葡萄糖苷（A22）、山柰酚-3-O-半乳糖苷（NA11）、咖啡酸（NA23）等8 类物质在两组数据中均只检测到痕量（表3、4），图中不另作比较。由图2可见，能够被定量的48 种酚类物质中有35 种物质位于纵坐标的正半轴（同属于图1中II组），表明乙烯利处理能提高其在葡萄酒中的质量浓度，而其余13 种物质位于纵坐标的下半轴（同属于图1中I组），受到乙烯利处理的负向影响，这与图1中I组与II组间单体呈现出显著负相关性的分析结果相一致。此外，FC大于2（即log2FC＞1）的酚类物质单体包括原花色素C1（NA6）、4-丙酮酸花翠素-3-O-(6-O-反式香豆酰化)葡萄糖苷（A30）、4-丙酮酸花翠素-3-O-(6-O-乙酰化)葡萄糖苷（A29）、异鼠李亭-3-O-葡萄糖苷（NA13）和槲皮素-3-O-葡萄糖苷（NA10），表明乙烯利处理对葡萄酒中的黄烷醇类、黄酮醇类及吡喃型花色苷类物质质量浓度的提高均具有较大的促进作用。

图1 酚类物质单体质量浓度变量间的相关性分析Fig.1 Correlation analysis of individual phenolics in different treatments

图2 样品间各酚类物质单体的差异倍数变化Fig.2 Fold change in concentrations of individual phenolics between two groups

2.6 PLS-DA分析结果

为明晰葡萄酒中某单一酚类物质组分对不同样本的分类贡献，本研究进一步对酚类物质单体质量浓度和总质量浓度数据建立了PLS-DA模型。在PLS-DA得分图中（图3A）可以看出，第一主成分解释了总变异的98.6%，第二主成分可解释0.8%的变异，且乙烯利处理组样品均位于X正半轴，对照组样品均位于X负半轴，对照组和乙烯利处理组的重复观察组均分别聚为一类并可被明显分开，由此可见，乙烯利处理组和对照组间酚类物质组分质量浓度差异显著。

为进一步找出对模型结果分离起贡献作用的物质，得到了PLS-DA模型的投影变量重要性（variable important for the projection，VIP）图（图3B），图中VIP值代表了各单体物质对不同组别的贡献，VIP值越大，该物质的质量浓度在处理组间的差异越显著，其对样本的分类贡献越大。本研究以VIP值大于1为界限进行筛选，共识别出3 种差异成分，以VIP值大于0.5为界限共识别出6 种差异成分或指标，依次为花色苷酚总质量浓度（A31）、二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷（A1）、二甲花翠素-3-O-(6-O-乙酰化)葡萄糖苷（A2）、甲基花翠素-3-O-(6-O-乙酰化)葡萄糖苷（A14）质量浓度以及非花色苷酚总质量浓度（NA27）、没食子酸（NA17）质量浓度。因此，花色苷酚中的二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷、二甲花翠素-3-O-(6-O-乙酰化)葡萄糖苷、甲基花翠素-3-O-(6-O-乙酰化)葡萄糖苷和非花色苷酚中的没食子酸是乙烯利处理组和对照组之间的主要差异成分，且这4 种成分在乙烯利处理组中具有较高的贡献值，这说明与对照相比，乙烯利处理能提高葡萄酒中二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷、二甲花翠素-3-O-(6-O-乙酰化)葡萄糖苷、甲基花翠素-3-O-(6-O-乙酰化)葡萄糖苷类花色苷和没食子酸类物质的质量浓度。此外，二甲花翠素-3-O-(6-O-反式香豆酰化)葡萄糖苷（A3）、儿茶素（NA5）和表棓儿茶素（NA1）对对照组样品的贡献较大，但VIP值较低，表明外源乙烯利处理不利于葡萄酒中香豆酰化的二甲花翠素葡萄糖苷类花色苷和儿茶素类的黄烷醇类物质的积累。

图3 不同处理组‘赤霞珠’葡萄酒酚类物质单体的PLS-DA分析Fig.3 Partial least squares discriminant analysis (PLS-DA) of individual phenolics between different treatments

2.7 外源乙烯利对葡萄酒中不同类别酚类物质质量浓度和比值的影响

葡萄果实和葡萄酒中的花色苷主要有花翠素、花青素、甲基花翠素、甲基花青素和二甲花翠素5 种主要形式，它们以单糖苷及其酰基化的衍生物的形式存在于葡萄果皮和葡萄酒中。本研究两组酒样中5 类花色苷质量浓度比较结果如图4A所示，二甲花翠素类是‘赤霞珠’葡萄酒中质量浓度最高的一类花色苷，其次是甲基花翠素类，而质量浓度最低的一类花色苷是花青素类。结果表明，与对照组相比，乙烯利处理显著提高了葡萄酒中二甲花翠素类、甲基花翠素类和甲基花青素类花色苷的质量浓度，花翠素和花青素类花色苷的质量浓度也表现为乙烯利处理组高于对照组，但差异不显著。

根据葡萄果实中花色苷代谢途径，花色苷可以分为来源于F3’H途径的花色苷和来源于F3’5’H途径的花色苷，来源于F3’H途径的3’-羟基取代花色苷包括花青素和甲基花青素类的糖苷态和酰基化糖苷态花色苷，来源于F3’5’H途径的3’5’-羟基取代花色苷，包括花翠素、甲基花翠素和二甲花翠素类的糖苷态和酰基化糖苷态花色苷[22]。如图4B所示，本研究中3’5’-羟基取代与3’-羟基取代花色苷的比例结果表明，乙烯利处理的葡萄酒中3’5’/3’-羟基取代花色苷的比例高于对照组，同时甲基化/未甲基化花色苷的比例也表现为乙烯利处理组高于对照组。本研究中葡萄酒花色苷的酰化包括乙酰化和香豆酰化，按照酰化/未酰化取代的花色苷比例进行分析，结果显示乙烯利处理组葡萄酒中酰化/未酰化取代的花色苷比例略低于对照组，但差异并不显著。吡喃花色苷是葡萄酒体重要呈色物质中的一种新型花色苷衍生物，基本结构是在5 种基本花色苷或其相应酰化花色苷的基础上，与乙醛、丙酮酸等化合物反应形成[23]，其对葡萄酒的橙红色色调贡献较大，具有较高的稳定性及良好的色泽特性[24-25]。本研究中检测到的吡喃型花色苷属于Vitisin A类吡喃花色苷，即为花色苷单体与丙酮酸反应形成[25]，而乙烯利处理也显著提高了吡喃/非吡喃花色苷的比例，使得葡萄酒的花色苷具有良好的色泽且稳定性增加。

图4 外源乙烯利对不同类别酚类物质质量浓度和比值的影响Fig.4 Effect of exogenous ethophen on the contents and ratios of different types of phenolics in wine samples

葡萄酒中的非花色苷酚类物质主要分为黄酮醇类、黄烷醇类、羟基苯甲酸类和羟基肉桂酸类4 类，如图4C所示，除羟基肉桂酸质量浓度低于对照组外，乙烯利处理能提高葡萄酒中黄烷醇、黄酮醇和羟基苯甲酸的质量浓度，且黄酮醇和羟基苯甲酸类物质与对照组间具有显著差异（P＜0.05）。

非花色苷酚类物质的来源也可以分为F3’H途径和F3’5’H途径。F3’H途径中二氢山柰酚可转化为二氢槲皮素，并进一步通过黄酮醇合成酶、无色花色素还原酶和花色素还原酶的催化作用，生成槲皮素、二氢槲皮素、异鼠李亭类黄酮醇和儿茶素、表儿茶素等二羟基黄烷醇，而F3’5’H途径中二氢山柰酚转化为二氢杨梅素，并通过原花色素合成酶、无色花色素还原酶和花色素还原酶的催化作用生成杨梅酮、二氢杨梅酮、丁香亭类黄酮醇和棓儿茶素、表棓儿茶素等三羟基黄烷醇[26]。本研究中，乙烯利处理组葡萄酒中3’5’/3’-羟基取代的黄烷醇和3’5’/3’-羟基取代的黄酮醇的比例均低于对照组（图4D），表明外源乙烯利处理使葡萄合成3’5’-羟基取代的非花色苷酚的代谢途径减少，更多地向合成3’-羟基取代的槲皮素类二羟基黄酮醇和儿茶素、表儿茶素类二羟基黄烷醇的方向流动。

3 讨 论

葡萄果实中的酚类物质可分为花色苷和非花色苷，除染色品种外，花色苷类物质主要在红色品种的果皮中合成，在葡萄果实成熟过程中，花色苷的合成主要受到光照、温度、激素等因素的影响[27-28]。前人的研究结果表明，外源乙烯处理的葡萄果实中具有较高含量的花翠素和花青素类物质，而利用乙烯受体抑制剂1-甲基环丙烯则显著抑制葡萄果实花色苷含量的积累[11,29-30]；进一步研究证明，外源乙烯处理是通过上调花色苷合成途径中的VvCHS、VvUFGT和VvMYBA1等基因的表达来促进花色苷的积累[14-15]。本研究中葡萄酒中的花色苷类物质以二甲花翠素和花翠素的单糖苷和乙酰化结合态的方式为主，乙烯利处理显著地提高了葡萄酒中的二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷、二甲花翠素-3-O-(6-O-乙酰化)葡萄糖苷、甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷、甲基花翠素-3-O-(6-O-乙酰化)葡萄糖苷和花色苷的总质量浓度，这与前人的研究结果[11,14,29]一致。基于前期研究指出葡萄酒中花色苷的总量与饱和度（C值）及红-绿色调（a值）呈显著的正相关[31]，本研究中乙烯利处理的葡萄酒色度指标a值和C值增加也可能与葡萄酒中花色苷质量浓度较高有关。此外，本实验中二甲花翠素、甲基花翠素、甲基花青素的反式香豆酰化的花色苷单体和花青素、花翠素的乙酰化及反式香豆酰化花色苷质量浓度则不受乙烯利处理的影响，可能与酰基转移酶基因的表达不受乙烯信号的调控有关，但具体作用机制有待进一步研究。

非花色苷酚包括酚酸类、黄酮醇类、黄烷醇类等物质，酿酒葡萄果实中黄酮醇类物质主要在果皮中合成和积累[32]，黄烷醇类物质则主要存在于果皮、果梗和种子中[33]，而酚酸类物质则主要贮存在葡萄果肉细胞中[34]。葡萄果实中非花色苷酚类物质含量受成熟度、栽培方式、环境因素如光照和温度等多种因素的影响[1,28]。前期的研究结果表明，外源乙烯利处理能够提高葡萄果皮中原花色素类物质的含量[15]。本实验的葡萄酒中非花色苷酚主要以儿茶素、表儿茶素和没食子酸等黄烷醇类和羟基苯甲酸类物质为主，乙烯利处理显著提高了葡萄酒中表儿茶素、没食子酸及非花色苷酚的总质量浓度，这与乙烯利处理能够上调葡萄果皮中与黄烷醇类物质合成有关的VvLAR1、VvLAR2、VvANR和VMYBPA1等基因表达有关[16]。酚酸类物质与植物的抗逆性有关，在遭受生物和非生物胁迫时植物体内的酚酸类物质会大量累积以提高抗逆性[34]，植物体内的酚酸类物质主要通过苯丙烷代谢途径生成，来自莽草酸途径的莽草酸经过转氨作用形成苯丙氨酸，随后在苯丙氨酸解氨酶（L-phenylalanine ammonia-lyase，PAL）、肉桂酸-4-羟化酶（cinnamate-4-hydroxylase，C4H）、香豆酰辅酶A连接酶（4-coumarate-CoA ligase，4CL）等作用下，分别形成反式肉桂酸、香豆酸、阿魏酸等酚酸[35]。有研究表明，乙烯、赤霉素、水杨酸等均能够诱导PAL、C4H和4CL活性和基因表达水平的增高[34,36-37]，本研究中乙烯利处理显著促进葡萄酒中没食子酸质量浓度的增高，可能是因为乙烯利通过激活苯丙烷类代谢酶系统的表达，参与了调控葡萄果实中酚酸类物质的合成。

葡萄酒的色度及颜色稳定性由花色苷的含量和组成决定，来源于F3’5’H途径的花翠素、甲基花翠素和二甲花翠素的单糖苷及其酰基化和吡喃型糖苷态类的花色苷属于3’5’-羟基取代花色苷，与3’-羟基取代花色苷相比具有更多的羟基[38-39]。一般羟基数量越多，花色苷的蓝色色调越明显，而甲氧基化越严重，花色苷的红色色调越明显，稳定性也越强[40]。本研究中，乙烯利处理组葡萄酒中二甲花翠素、甲基花翠素和甲基花青素类花色苷质量浓度显著增加，同时3’5’-羟基化和甲基化花色苷的比例均上升，PLS-DA研究结果也进一步证明二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷、二甲花翠素-3-O-(6-O-乙酰化)葡萄糖苷和甲基花翠素-3-O-(6-O-乙酰化)葡萄糖苷3 类物质对乙烯利处理组的分类贡献较大，这说明乙烯利处理能够使葡萄酒中的花色苷的甲基化水平和羟基化水平增高，这对葡萄酒的红蓝色调和色泽稳定性起到积极作用。Cano-Lopez等指出，吡喃型花色苷对葡萄酒中的红-黄色色调的贡献较大[41]，乙烯利处理后的葡萄酒中吡喃型花色苷的比例显著上升，进一步表明乙烯利处理使葡萄酒整体的颜色更深，并呈现出更加偏向红-黄色的表现，这也与葡萄酒的红绿色调（a值）和黄蓝色调（b值）上升的研究结果相一致。

葡萄酒中非花色苷酚类物质黄烷醇和黄酮醇物质按其羟基化程度不同也可分为3’5’-羟基化取代的三羟基和3’-羟基取代的二羟基黄烷醇或黄酮醇。前人研究结果指出，儿茶素、表儿茶素类二羟基黄烷醇与棓儿茶素、表棓儿茶素类三羟基黄烷醇相比具有更强的抗氧化能力[42]，同时二羟基黄酮醇中的槲皮素比三羟基黄酮醇中的杨梅酮相比具有更强的清除活性氧自由基的能力[43]。本研究中乙烯利处理后的葡萄酒中3’5’/3’-羟基取代的黄烷醇和3’5’/3’-羟基取代的黄酮醇的比例均低于对照组，表明乙烯利处理后葡萄果实非花色苷酚的代谢途径向3’的方向流动增加，二羟基黄烷醇与二羟基黄酮醇比例增加，进而使得乙烯利处理的葡萄酒具有更强的抗氧化和活性氧自由基清除能力。

综上所述，乙烯利处理葡萄果实能提高葡萄酒色度值及红黄色色调，并提高葡萄酒中以二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷和二甲花翠素-3-O-(6-O-乙酰化)葡萄糖苷为主的大部分单体花色苷及以表儿茶素和没食子酸为主的大部分单体非花色苷酚质量浓度。乙烯利处理能够提高葡萄酒中3’5’-羟基取代、甲基化和吡喃型花色苷的比例，并提高3’5’-羟基取代的黄烷醇和3’5’-羟基取代的黄酮醇类物质的比例。田间应用乙烯利处理的葡萄酒具有较高质量浓度的花色苷和非花色苷酚，可被选用于酿酒葡萄的栽培生产中。