KIF4A在肝细胞癌中的表达及预后价值分析

蓝祝晶，王继龙，王珏，易麒麟，王维，黄柯豫，金宗睿，吴国林，朱海，徐邦浩，郭雅，文张

（广西医科大学第一附属医院肝胆外科，广西南宁530021）

原发性肝癌是全球第六大常见癌症和第三大癌症相关死亡原因。 其中， 肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是原发性肝癌最常见病理类型（占75%～85%）。世界癌症最新统计数据显示，2020年全球新增HCC 病例约724 800 例，死亡约664 000 例[1]。而我国HCC 的发病率和病死率仍居世界首位，是第二大癌症相关死亡原因[2]。尽管HCC 患者的早期发现率已有很大提高，但5年生存率仍然不到35%[3]。HCC 是一种异质性很强的疾病，遗传变异和细胞微环境对肿瘤的发生、发展和转移都有一定影响[4]。目前，获得普遍认可的HCC 早期诊断的方法包括甲胎蛋白（alpha fetoprotein, AFP）检测、B 超和CT 等影像检查，但存在一定的误诊率[5-6]。因此，深入探讨HCC 的发生发展机制，寻找敏感度高的分子标志物，对HCC早期诊断、临床治疗和预后预测有着重要的意义。

驱动蛋白超家族蛋白（kinesin superfamily proteins，KIFs） 分为14 个亚家族[7]，是以微管（MT）为基础的马达蛋白，含有一个保守的运动催化结构域，与ATP 结合并水解ATP，产生能量，从而参与各种细胞质成分的运输和MT 稳定性的调节[8]。驱动蛋白超家族成员在细胞分裂中起着关键作用，特别是在有丝分裂不同阶段，参与调节有丝分裂纺锤体的形成、取向和伸长，以及有丝分裂中染色体的分离[9]。KIF4A 是KIFs 中的一员，也是重要的染色体相关分子马达，定位于人类基因组中的Xq13.1，编码1 个由1 232 个氨基酸组成的分子量为140 kDa 的蛋白质[10]。KIF4A 参与了多种重要的细胞过程，特别是有丝分裂过程中染色体凝聚和分离的调控[11]，KIF4A 的异常表达被认为与纺锤体异常分离和子细胞的非整倍体有关[12]，从而进一步导致遗传物质的异常分布。既往研究发现，KIF4A 在肾细胞癌组织中表达上调，且KIF4A高表达与肾细胞癌患者的肿瘤发生、转移和预后显著相关，可作为肾细胞癌的潜在治疗靶点[13]。在食管癌中的研究表明，KIF4A 可通过调控Hippo信号促进肿瘤细胞增殖、迁移并提示食管鳞状细胞癌患者的不良预后[14]。而在肺腺癌、胆管癌、乳腺癌、膀胱癌中的研究显示，KIF4A 与上述肿瘤的进展密切相关，并具有一定的预后预测价值[15-18]。目前，KIF4A 在HCC 中的研究报道相对较少，因此，本研究拟采用生物信息学方法结合免疫组织化学染色分析KIF4A 基因在HCC 中的表达水平及预后价值，并探讨其潜在的分子机制。

1 材料与方法

1.1 数据来源

从TCGA 数据库门户网站（https://portal.gdc.cancer.gov） 下 载HCC 的mRNA 表达数据，包含有374 例肝肿瘤组织和50 例正常肝组织，并同时下载相关临床病理资料的数据集，临床病理资料包括年龄、性别、肿瘤临床分期、肿瘤组织学分级、TMN 分级和生存时间等。

1.2 KIF4A在正常肝组织和HCC组织中的表达验证

利用从TCGA 下载的基因表达数据，通过R 软件（4.0.4）中“Limma”包工具分析KIF4A 在正常肝组织和HCC 组织中的表达水平。

1.3 列线图的构建

将相关临床病理因素纳入预测模型，使用R软件（4.0.4） 中“Hmisc”、“lattice”、“Formula”、“ggplot2”、“foreign”和“rms”包工具构建预测HCC 患者预后的列线图。

1.4 患者组织样本和伦理声明

回顾性收集2020年1月—2020年3月在广西医科大学第一附属医院行肝肿瘤切除术的20 例HCC 患者的癌组织及相应癌旁组织标本（切片厚度4 μm），10%中性福尔马林室温固定16 h，石蜡包埋。入选标准如下：⑴性别不限，年龄＞18 岁；⑵肝肿瘤根治性切除；⑶病理诊断为HCC。排除标准包括：⑴合并其他肿瘤；⑵术前接受放疗或化疗；⑶拒绝签署知情同意书。本研究是根据“赫尔辛基宣言”进行的，在研究之前，所有患者都签署了知情同意书，并获得了伦理委员会批准。

1.5 免疫组化染色

对石蜡包埋的组织样本切片后进行脱蜡并水化。用柠檬酸缓冲液（0.01 mol/L）高压12 min 进行抗原修复，冷却5 min，然后PBS 缓冲液洗涤3 min×3 次。再用3%过氧化氢溶液处理，以阻断内源性过氧化物酶活性。用山羊血清白蛋白（BSA）封闭，后加入稀释的一抗，在4 ℃下孵育过夜。次日加二抗，室温敷育20 min，PBS 缓冲液洗涤3 min×3 次。DAB 显色、苏木素复染、0.25%的盐酸乙醇中浸没后洗涤，室温晾干后封片。

1.6 基因集富集分析（GSEA）

为了分析KIF4A 潜在调控的分子信号通路，我们使用从TCGA 获得的标准化RNA-Seq 数据进行基因集富集分析。以75%的临界值为基础，在转录组水平上分析KIF4A 高表达和低表达之间的代谢途径和生物学过程。采用GSEA 软件（v4.1.0） 对KIF4A 高表达和低表达之间的差异代谢途径和生物过程进行分析。GESA 参数设置选择c2KEGG 基因集（c2.cp.kegg，V6.2.symbol s.gmt），基因集排列数量设定为1 000 个，标准化的P＜0.05 和错误发现率＜0.25 的富集结果被认为具有统计学意义。

2 结 果

2.1 KIF4A基因在HCC组织中高表达

利用从TCGA 下载的HCC 基因表达数据，使用R 软件（4.0.4） 中“Limma”包工具分析KIF4A 在正常肝组织和HCC 组织中的表达水平。如图1 所示，KIF4A 在HCC 组织中的表达水平显著高于正常肝组织（P＜0.001）。

2.2 KIF4A表达与临床病理特征的关系

进一步分析KIF4A 表达水平与HCC 患者临床病理特征的关系。结果显示，KIF4A 表达水平与组织学 分 级（P＜0.001）（图2A）、临床分期（P＜0.001）（图2B）明显有关。与KIF4A 低表达患者相比，KIF4A 高表达HCC 患者组织学分级和临床分期往往更高。

2.3 KIF4A表达与HCC患者预后的关系

根据KIF4A 表达量的中位值将HCC 患者分为KIF4A 高表达组和低表达组。采用Kaplan-Meier 生存分析方法分析KIF4A 高表达组和低表达组患者的生存状况。如图3A 所示，KIF4A 高表达组患者总体生存时间（overall survival，OS）明显短于低表达组患者（P=0.002）。采用随时间变化的受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线评估KIF4A 在TCGA 数据集中预测HCC 预后的敏感度和特异度。结果显示ROC 曲线1、3、5年OS 的曲线下面积（area under curve，AUC） 分别为0.783、0.662、0.574 （图3B），提示KIF4A 预测HCC 患者预后的敏感度和特异度较高。上述数据表明KIF4A高表达提示HCC 患者预后差，是一个潜在的HCC预后预测分子标志物。

采用Cox 回归单、多因素分析探讨影响HCC患者预后的独立危险因素。单因素Cox 回归分析结果表明，HCC 患者的临床分期（HR=2.084，95%CI=1.590～2.733，P＜0.001）、T 分期（HR=1.980，95%CI=1.541～2.543，P＜0.001）和KIF4A表达水平（HR=1.113，95%CI=1.062～1.167，P＜0.001）与OS明显有关；多因素Cox 回归分析结果显示，KIF4A 高表达（HR=1.089，95%CI=1.034～1.147，P=0.001）是影 响HCC 患者预后的独立危险因素（表1）。

表1 Cox回归分析HCC患者预后的独立危险因素Table 1 Cox regression analysis of independent risk factors affecting the prognosis of patients with HCC

2.4 列线图预测HCC患者预后

综合分析包括KIF4A 表达水平在内的各临床病理因素与HCC 患者预后的关系，并利用R 软件绘制列线图，以便更直观地了解各临床病理因素对HCC 患者预后的预测能力。将不同的临床病理因素赋予相应的分值，通过相加得到总分值，最后根据总分值评估每位HCC 患者的1、3、5年生存率。列线图上的总分值越高，提示预后越差。从图4 可以看出，KIF4A 表达水平对总分值有显著影响，而其他临床病理因素对总评分的影响相对较小。

2.5 免疫组化法证实KIF4A 在HCC 组织中高表达

应用免疫组织化学方法检测HCC 组织和相应癌旁肝组织中KIF4A 蛋白的表达和亚细胞定位。KIF4A 蛋白的免疫染色主要定位于HCC 细胞的胞浆和胞核中。KIF4A 在HCC 组织中呈阳性表达，而在癌旁肝组织中呈弱阳性或阴性表达。与相应癌旁组织相比，HCC 组织中KIF4A 蛋白的表达水平显著升高（图5）。

2.6 KIF4A基因功能富集分析

通过GSEA 富集分析，探讨KIF4A 潜在的生物学功能。结果显示，与KIF4A 高表达相关的基因集参与调控碱基切除修复、细胞周期调控、DNA 复制、错配修复、mTOR 信号通路、核酸切除修复、P53 信号通路、癌症通路、磷脂酰肌醇信号传导等9 条信号通路（图6）。

3 讨 论

HCC 是最常见肿瘤之一，近年来其患病率持续上升[19]。肝切除、肝移植和局部消融术仍然是目前最有效根治手段，但HCC 患者5年生存率依然较低[20-21]。很多HCC 患者在确诊时就已经处于中晚期且常合并有严重的肝硬化，这些患者不适合行手术切除或肝移植治疗[22]。因此，寻找到新的敏感度高的分子标志物和治疗靶点对改善HCC 患者预后至关重要。

KIFs 共有一个保守的运动区，并且有一类微管依赖的分子马达蛋白被证明参与多种细胞活动，包括有丝分裂、细胞器和囊泡运输等。KIF4A 是一种属于Kinesin 4 亚家族的N 型Kinesin，含有ATP酶/运动结构域，可以与微管结合，提供动力，在有丝分裂纺锤体形成和染色体分离过程中发挥关键作用[23]。以往研究发现，KIF4A 在一些恶性肿瘤中高表达与患者的不良预后有关。如Song 等[15]基于生物信息学分析发现KIF4A 作为枢纽基因，促进肺腺癌的进展，与患者的不良预后显著相关，并可能成为肺腺癌治疗的潜在治疗靶点。Yang 等[24]综合生物信息学分析发现KIF4A 是与卵巢癌患者预后密切相关的关键基因，可作为卵巢癌潜在的预后生物标志物。此外，Huang 等[25]基于Oncomine 数据库的Meta 分析发现KIF4A 基因在HCC 中表达上调，并通过激活Akt 信号促进细胞增殖并预测HCC的不良预后。也有文献[26]报道上调KIF4A 的表达可促进FOXM1 介导的HCC 细胞增殖和肿瘤生长，提示FOXM1-KIF4A 轴可能成为HCC 治疗的潜在靶点。Matsushita 等[27]利用TCGA 数据库中的DNA 甲基化数据分析发现KIF4A 启动子附近的CpGis 低甲基化，并与HCC 的预后密切相关。本研究使用TCGA 肝癌数据库分析发现KIF4A 在HCC 组织中的表达显著高于正常肝组织，还通过免疫组织化学检测发现与相应的癌旁组织相比，HCC 组织中KIF4A 蛋白的表达水平显著升高，进一步验证了KIF4A 基因在HCC 组织中可能发挥致癌作用。 临床病理因素相关性分析发现KIF4A 表达与HCC 患者的组织学分级、临床分期显著相关。Li 等[28]基于UALCAN 在线数据库分析发现KIF4A 上调与HCC 患者的肿瘤分期和病理分级密切相关，这与本研究结果一致。本研究分析KIF4A 高表达和低表达患者的生存预后，结果显示KIF4A 高表达组患者总体生存时间短于低表达组患者。此外，本研究利用TCGA 数据构建了预测HCC 患者预后的列线图，有助于更加直观地了解KIF4A 表达水平在HCC 预后预测方面的重要性。Cox 回归单因素分析显示HCC 患者的临床分期、T 分期和KIF4A 表达水平与OS 显著相关；Cox 回归多因素分析发现KIF4A 高表达是影响HCC患者预后的独立危险因素。上述研究结果显示，KIF4A 高表达提示HCC 患者预后差，有可能成为HCC 患者预后预测的潜在分子标志物。

为了探讨KIF4A 在HCC 进展中的潜在分子机制，本研究使用从TCGA 获得的标准化RNA-Seq 数据进行GSEA 富集分析。结果提示KIF4A 基因高表达组HCC 样本主要富集于碱基切除修复、细胞周期调控、DNA 复制、错配修复、mTOR 信号通路、核酸切除修复、P53 信号通路、癌症通路、磷脂酰肌醇信号传导通路等生物学过程。以往研究表明，KIF4A 参与细胞周期调控并在DNA 修复、DNA 复制、纺锤体组织和胞质分裂中发挥重要作用[29-30]。Wang 等[31]报道KIF4A 可通过细胞周期相关途径促进食管鳞状细胞癌的细胞增殖和迁移。最近研究[32]表明KIF4A 可加快乳腺癌的进展，并参与调控错配修复、P53 信号通路。在HCC 中，Chen 等[33]研究发现KIF4A 可通过调控细胞周期促进肿瘤进展，并与HCC 患者预后显著相关。Hou 等[34]研究显示KIF4A 通过影响细胞周期、有丝分裂相关通路和P53 信号通路促进HCC 细胞增殖和迁移。此外，Li等[28]也报道了KIF4A 参与HCC 细胞的细胞周期调控，并与HCC 的不良预后有关。与上述研究结果一致，本研究GSEA 富集分析结果也表明KIF4A 高表达可能通过细胞周期调控、DNA 复制、错配修复、P53 信号通路促进HCC 的进展，从而导致HCC患者预后不良。此外，本研究中GSEA 富集分析结果提示KIF4A 影响HCC 预后的潜在机制可能还涉及碱基切除修复、mTOR 信号通路、核酸切除修复、癌症通路、磷脂酰肌醇信号传导通路等途径，此发现进一步拓宽了对KIF4A 在HCC 发生发展过程中作用的认识。然而，这些机制尚需在后续研究中使用体内和体外实验进一步验证。

综上所述，本研究利用TCGA 数据进行生物信息学分析，结合免疫组织化学验证，发现KIF4A 在HCC 组织中高表达，且提示HCC 患者预后差，KIF4A 表达水平是影响HCC 患者预后的独立危险因素，提示KIF4A 有可能成为HCC 患者预后预测的潜在分子标志物。GSEA 富集分析进一步显示碱基切除修复、细胞周期调控、DNA 复制、错配修复、mTOR 信号通路、核酸切除修复、P53 信号通路、癌症通路、磷脂酰肌醇信号传导通路等可能在KIF4A 促进HCC 进展中发挥重要作用，这为以后进一步阐明KIF4A 在HCC 发生发展中的作用机制提供了理论基础。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。