亚临界流体萃取高效脱除枸杞中的农药残留

沈艺楠，王云，刘星汶，赵云鹏，张尚微，杨继国,*

（1.华南理工大学食品科学与工程学院，广东广州 510640）（2.华南协同创新研究院，广东东莞 523808）

枸杞（Lycium barbarum）作为一种传统中药材，其生物活性成分在抗肿瘤[1]、抗氧化、抗炎[2]、改善肠道微环境[3]等方面具有重要作用。由于枸杞生长过程中易受到病虫害威胁而导致其产量降低，人们在种植过程中广泛使用有机磷类、菊酯类等农药[4]，使得农药使用量超标现象日益明显，严重影响其品质和使用安全。目前国内外均颁布了相关药典对中药材农药残留限量进行了规定，我国在2015版的《药典》第四部中新增了“第五法 药材及饮片（植物类）中禁用农药多残留测定法”，以及33项关于中药材农残监控项目[5]。国家对农残的监管力度日益加大[6]，解决枸杞等中药材中农药残留问题具有重大意义。

目前，对于枸杞等中药材农药残留的脱除方法主要包括化学法、生物法和物理法[7]。首先，化学法是采用化学试剂降解农药成分以降低其毒性，但常用试剂如臭氧、过氧化氢等残留会带来严重的二次污染问题[8]。生物法脱除农药残留是指利用天然微生物、基因工程菌等将农药大分子分解为小分子化合物，具有较高广谱性，但是基因工程价格昂贵，且中间代谢产物复杂，难以分析其毒性和生物安全性。物理法如传统的储藏法、炮制法脱除残留农药的范围有限，仅分别适用于性质不稳定、易分解和热敏感农药[9]；上世界八十年代超临界流体萃取技术（SFE）开始用于农药残留的脱除，它是利用物质在临界压力和温度以上时溶解力更强的特性来萃取农药分子[10]，但该方法要求操作压力范围为15～30 MPa，致使其设备成本及运行能耗偏高，不适用于大规模工业生产[11]。

亚临界萃取技术是通过控制一定压力和温度，使萃取剂处于亚临界状态，此时的萃取剂具有较好的渗透性和溶解性，可更好的萃取分离目标产物[12]。由于其操作温度范围在20～60 ℃，压力控制0.3～0.8 MPa，故可有效避免对物料本身造成伤害，是一种绿色环保、节能安全的萃取分离技术。目前它被广泛应用于油脂[13]、植物色素[14]、香精[15]等的提取，在脱除农药残留方面也有涉及，但多数研究局限于蔬菜和水果[16-18]、茶叶[19]、环境[20]中农药残留检测，而对于中药材中农药残留脱除应用较少。张民等[21]利用亚临界丙烷萃取脱除人参提取物中有机氯农药，研究表明，在萃取压力为8 MPa、65 ℃下萃取120 min，溶剂流量为2.94 kg/h的条件下，可几乎完全脱除γ-HCH、op-DDT，对TCNB、pp-DDT、DDE脱除率大于60%。此外还有秦广雍等[22]、刘智谋等[23]进行了相关研究，但也都仅限于中药材人参中有机氯农药的脱除。由于中药材种植过程使用的农药种类繁多且极性复杂，而现阶段亚临界萃取脱除农残多是采用单一溶剂、针对单一种类农药，缺乏对不同种类农药多残留的脱除研究。因此本实验以中药材枸杞为原料，添加植物种植过程中常见的7种不同极性的农药（理化性质具体见表1），采用混合萃取剂丁烷和乙醇，以改善萃取剂极性，扩大脱除农药极性范围，探究其对该7种农药的脱除效果，以建立适用性更广、更高效的亚临界流体脱除中药材中农药残留的方法。

表1 七种不同农药的理化性质Table 1 Physical and chemical properties of seven different pesticides

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

农药均为市购，包括有机磷类（毒死蜱）、菊酯类（氯氟氰菊酯、氯氰菊酯）、杀菌剂类（多菌灵）、烟碱类（吡虫啉）、苯基吡唑类（氟虫腈）、氨基甲酸酯类（克百威）；枸杞，批号为 KPGQGG-18-47，来自青海康普生物科技股份有限公司；无水乙醇（食品级）、正丁烷（分析纯）、浓硫酸，天津科密欧化学试剂有限公司；乙醇（色谱纯），上海麦克林生化科技有限公司；实验用水为超纯水（18 MΩ.cm）

1.2 仪器与设备

LCMS8045型高效液相色谱-质谱联用仪，岛津（上海）实验器材有限公司；BJ-150型高速多功能粉碎机，德清拜杰电器有限公司；IX73型荧光显微镜，日本 OLYMPUS；BSA-224S型分析天平，德国赛多利斯；T-9000型电子天平，常熟双杰测试仪器厂；200 L亚临界流体萃取小试系统，河南亚临界萃取技术研究院有限公司。

1.3 方法

1.3.1 亚临界流体脱除中药材枸杞中农药残留工艺流程

首先将枸杞置于萃取罐中，关闭进料口，抽真空使萃取罐内压力降至0.01 MPa以下后，加入液化亚临界流体溶剂进行萃取。待萃取结束后，萃取物和萃取剂一起进入溶剂分离罐。通过减压回收分离罐中的萃取剂，回收后的萃取剂可以循环使用，萃取物通过分离罐底部排料口排出。

1.3.2 试验样品制备

将7种不同类型的农药分别溶解于80%乙醇溶液中得到农药混合液，控制乙醇中不同类型的农药浓度为GB 2763-2019标准中规定的检出限的10倍，其中氟虫腈的浓度以NY/T 1379-2007标准中检出限的10倍来计。

将枸杞浸没于上述农药混合液中，枸杞与农药混合液质量比为1:1，5 s后取出物料，晾干后装于塑料袋中，密封，待检。

1.3.3 不同种类农药残留检测方法

不同种类农药残留检测送至广州中科检测技术服务有限公司，具体检测方法参照《中国药典》2015版第四部农药多残留量测定法-质谱法，最低检出限除氯氰菊酯为0.025 mg/kg以外，其它均为0.005 mg/kg。

1.3.4 亚临界流体脱除枸杞中农残的试验设计

1.3.4.1 单因素试验

采用常见的亚临界丁烷单一溶剂和不同比例的亚临界丁烷-乙醇混合溶剂（丁烷:乙醇为1:1、2:1、10:1（m/m））进行萃取，以筛选合适的亚临界脱农残的溶剂，并以未经过亚临界萃取处理的枸杞作为空白对照，测定并计算亚临界处理前后农残的脱除率，在张民等[21]前人所探究的工艺条件基础上，结合实验室设备允许工艺参数范围，设置亚临界流体脱除中药材农残因素水平，分别考察不同萃取温度（20、30、40、60 ℃）、萃取时间（20、30、40、60 min）、萃取次数（1、2、3次）对7种农残脱除率的影响。

1.3.4.2 亚临界流体脱除枸杞中高浓度农药残留的工艺验证试验

将样品枸杞分别按照7种农药的最高检出限100倍浓度添加农药，利用上述单因素试验条件进行亚临界流体脱除农药残留试验以验证该工艺对枸杞中不同种类高浓度农药残留的脱除效果。

1.4 亚临界萃取处理对枸杞理化指标的影响

表面结构观察：利用荧光显微镜，将未经过亚临界流体脱农残处理、处理后的干枸杞均匀切片，分别置于显微镜玻片上进行外表面的观察。

水分、枸杞多糖、甜菜碱等指标检测方法参照《中国药典》（2015版）第四部通则。

1.5 数据分析

本文采用Excel 2016和Origin 2018对数据进行处理和分析，每组实验设置3个平行组。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 萃取溶剂对不同种类农残脱除率的影响

针对不同极性大小的农药，分别使用单一溶剂丁烷、不同比例丁烷-乙醇混合溶剂（1:1、2:1、10:1）（m/m）对中药材枸杞进行亚临界脱农残处理，其它条件为溶料比2:1（m/m），萃取温度30 ℃，时长40 min，萃取次数1次。所得不同种类农药的脱除率如图1所示。

整体来看，添加乙醇能够显著改变亚临界流体的极性，进而扩大农药脱除范围，这与超临界提取多酚物质的原理相似[24]。在未添加乙醇的情况下，由于亚临界萃取溶剂丁烷的极性限制，农药克百威的脱除效果最差。随着乙醇含量的增加，萃取溶剂的极性发生变化，7种农药的脱除率均有所上升，在丁烷:乙醇为2:1（m/m）时，克百威、氟虫腈、氯氟氰菊酯和毒死蜱的脱除率分别为100%、92.59%、90.41%、93.58%。当丁烷:乙醇为10:1（m/m）时，各种农药的脱除率变化不大。因此，综合实际成本考虑选择丁烷:乙醇为2:1（m/m）为最佳溶剂比。

2.1.2 萃取温度对不同种类农残脱除率的影响

采用萃取剂丁烷:乙醇2:1（m/m），在料液比为2:1（m/m）、萃取时长40 min、次数为1的条件下，控制萃取温度分别为 20、30、40、60 ℃，考察温度对枸杞中7种农残脱除效果的影响。已知随着温度的升高，溶质的溶解度增大，分子热运动速率加快，分子间相互碰撞几率也会增大，农药分子脱除率上升。由图 2可知，在20～30 ℃范围内，随着温度的升高，7种农药的脱除率整体上呈上升趋势，且在30 ℃时克百威、氟虫腈、氯氟氰菊酯的脱除率达到最高，分别为100%、91.24%、91.77%。温度超过30 ℃时，部分农药的脱除率下降，可能是因为温度过高导致枸杞内部功效成分枸杞油和枸杞色素在萃取剂中溶解，进而影响了农药的脱除效果。综合考虑实际生产能耗问题，选择30 ℃为最佳萃取温度。

2.1.3 萃取时间对不同种类农残脱除率的影响

采用溶剂丁烷:乙醇 2:1（m/m），在料液比为 2:1（m/m）、萃取温度为30 ℃、次数为1的条件下，控制萃取时间分别为20、30、40、60 min，考察不同时长对枸杞中7种农残脱除效果的影响，实验结果见图3。当萃取时间由20 min增加到40 min时，农药的脱除率均不同程度的上升，克百威、氟虫腈和氯氟氰菊酯的最高脱除率可分别达98.57%、93.66%和92.85%。随着萃取时间延长，农药的脱除率基本不变或略有下降，说明溶剂已和样品表面充分接触，溶解趋于饱和或者样品遭到重复污染，致使农药残留量增加，这与张民等的实验结果相似[21]。因此综合选择40 min为最佳萃取时间。

2.1.4 萃取次数对不同种类农残脱除率的影响

采用溶剂丁烷:乙醇 2:1（m/m），在料液比为 2:1（m/m）、萃取时长40 min、萃取温度30 ℃的条件下，控制萃取次数分别为1、2、3次，考察萃取次数对枸杞中7种农残脱除效果的影响。由图4可以看出对于农药克百威萃取1次脱除率即可达到100%，其它农药在萃取第二次时，脱除率均有所增加，说明萃取剂继续溶解农药，而在萃取第三次时，各种农残的脱除率基本保持不变，说明枸杞表面大部分的农残经过前两次萃取基本已脱除完全。综合经济成本，选择两次为最佳萃取次数。

2.2 亚临界流体脱除枸杞中高浓度农药残留的工艺验证试验

采用溶剂丁烷:乙醇 2:1（m/m），在料液比为 2:1（m/m）、萃取时间40 min、温度30 ℃、萃取2次的条件下，考察亚临界流体对添加7种高浓度农药的枸杞农药残留脱除情况，具体结果见下表。由表2可以看出，农药克百威、氟虫腈、氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、毒死蜱、吡虫啉和多菌灵的脱除率均在80%以上。总的来看，上述亚临界流体萃取技术对脱除中药材枸杞中农药残留具有较好效果。

表2 亚临界流体对枸杞中不同种类农药残留的脱除效果Table 2 Effect of subcritical fluid on the removal of pesticide residues in Lycium barbarum

表3 亚临界萃取处理对枸杞水分、多糖等生化成分的影响（%）Table 3 Effect of subcritical extraction treatment on water and polysaccharide of Lycium barbarum

2.3 亚临界萃取处理对枸杞理化指标的影响

2.3.1 亚临界萃取处理对枸杞生化成分的影响

采用溶剂丁烷:乙醇 2:1（m/m），在料液比为 2:1（m/m）、萃取时间40 min、温度30 ℃、萃取2次的条件下对枸杞进行亚临界脱除农残试验，然后对处理前后枸杞中成分进行检测，具体结果见表3。经t检验，p＞0.05，这表明亚临界流体脱除农药残留对枸杞中的主要生化成分影响不显著。

2.3.2 亚临界萃取处理对枸杞表面结构的影响

采用溶剂丁烷:乙醇2:1（m/m），在料液比为2:1（m/m）、萃取时间40 min、温度30 ℃、萃取2次的条件下对中药材枸杞进行亚临界脱除农残试验，然后对处理前后的枸杞进行表面结构观察（见图5、6）。采用荧光显微镜放大100、200倍观察可知，除脱除农残后枸杞表面褶皱纹路有舒展外，其表面结构无明显区别。亚临界流体脱除农残是一种对物料外观无影响，可保证产品品质的无损温和脱除技术。

3 结论

为广泛探究亚临界流体萃取技术对中药材农药残留的脱除效果，本实验以添加了7种不同种类、不同极性农药的枸杞为原料，在萃取剂丁烷:乙醇为 2:1（m/m），料液比为2:1（m/m）、萃取时间40 min、温度30 ℃、萃取2次的条件下对枸杞进行亚临界流体脱除农残试验，克百威、氯氟氰菊酯、氯氰菊酯和毒死蜱的脱除率均在90%以上，分别为95.53%、92.73%、93.58%和93.41%，而吡虫啉、多菌灵和氟虫腈的脱除率也均在85%以上，分别为86.61%、89.04%和89.59%。枸杞中多糖、甜菜碱和水分的损失率分别为4.50%、4.41%和0.54%，处理前后含量基本不变，显微镜下观察枸杞表面结构也没有明显变化。前人研究中，罗金凤等[25]采用不同清洗剂对水果中农残毒死蜱、氯氰菊酯进行洗脱，最高脱除率为33%和34%；韩玉谦等[26]利用超临界 1,1,1,2-四氟乙烷萃取技术脱除人参中残留农药，对有机氯农药脱除率可达91.5%。对比本文可见，亚临界流体萃取技术对枸杞中农药残留达到了较高的脱除效果。因此，亚临界流体萃取技术对于脱除中药材枸杞中各类农药具有广泛适用性。本文为广泛脱除中药材农药残留提供了一定的数据支撑，也为企业进一步开发利用枸杞等中药材资源提供了安全保障。