葡萄籽提取物和茶多酚抑制高氧气调包装牛肉饼的提前褐变现象

许宝琛，张一敏，罗欣，马伟民，杨振刚，梁荣蓉*

（1.山东农业大学食品科学与工程学院，山东泰安 271018）（2.君博食品有限公司，山东临清 252600）（3.亿利源清真肉类有限公司，山东阳信 251800）

生鲜肉色决定着消费者对生鲜肉品的购买欲，而熟制肉色影响着消费者对肉品熟制程度的判断[1,2]。正常牛肉制品在加热过程中，肉色会由红向棕褐色转变，当中心肉色完全变为棕褐色时，说明此时肉品熟制完成[3]。提前褐变现象（Premature Browning，PMB）是牛排和牛肉饼加热过程中的一种非典型颜色变化，它是在低于破坏食源性病原体所需温度时，中心肉色提前由红色变为褐色，使消费者误以为此时的肉饼已熟制完全，达到安全食用状态[4,5]。因此，该现象容易导致食品安全问题。为防止 PMB现象引起的食源性疾病，美国农业部建议，牛肉饼的熟制中心温度不能低于 71.1 ℃[6]。

很多因素可以引起 PMB现象，已有研究发现，高氧气调包装的牛肉由于贮藏期间的氧化程度较大，在加热过程中更易发生PMB现象[7]，因此，通过添加抗氧化剂来降低氧化程度是抑制 PMB现象的一种有效手段[8]。Sørheim等[9]向碎牛肉中分别加入了抗坏血酸、迷迭香提取物、乳酸钠、多聚磷酸盐和林贡莓汁，发现仅多聚磷酸盐减少了 PMB现象的发生。Ramanathan等[5]通过向碎牛肉中添加琥珀酸盐和氢氧化铵，加热后发现琥珀酸盐可以抑制 PMB现象的发生，而加氢氧化铵的碎牛肉仍会产生 PMB现象。此外，壳聚糖和抗坏血酸等添加物均可对 PMB现象的发生起到一定的抑制作用[10,11]。

目前，天然抗氧化剂凭借其安全、高效的优点在肉品工业中得到了广泛应用，但大多都以其对生肉的抗氧化性和抑菌作用为立足点进行研究，其对加热后肉色变化的影响还鲜有报道。因此，本实验选取抗氧化效果较好的葡萄籽提取物和茶多酚两种天然抗氧化剂，探究两种抗氧化剂对 PMB现象的抑制效果，旨在为肉制品 PMB现象的控制提供技术支持和数据参考，提高食品安全性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

西冷牛肉及脂肪，山东阳信亿利源清真肉类有限公司；PCA琼脂培养基，陆桥科技股份有限公司；茶多酚（90%），上海义润生物工程有限公司；葡萄籽提取物（85%），西安萃之健生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

SenvenGo pH计，瑞士 Mettler Toledo公司；BagMixrrR 400拍打器，法国Interscience公司；SP62便携式积分球分光光度仪，美国 X-Rit公司；DT-6D气调包装机，大江机械设备有限公司；C/E652肉饼成型机，意大利La Minerva公司。

1.3 实验设计

选取正常pH值范围的牛背最长肌，真空包装后0～4 ℃条件下运回实验室。经修整绞碎后（包括15%的脂肪），平均分为三组，分别为对照组（未添加天然抗氧化剂）、葡萄籽提取物处理组和茶多酚处理组。各组原料肉绞碎后分别添加0.1 g/kg的葡萄籽提取物和0.1 g/kg的茶多酚（充分溶解后添加），并同时添加10%水和 2%食盐，各组物料分别混合均匀后，低速斩拌15 s，使用肉饼成型机制成9 cm直径、1.5 cm厚的肉饼，进行高氧气调包装（80% O2+20% CO2），置于0～4 ℃环境中贮藏 0、3、6 d。在每个时间点将肉饼取出，测定生肉pH值、肉色、脂质氧化值和菌落总数，同时将肉饼在177 ℃的温度下分别煎制至中心温度66 ℃、72 ℃，测定肉饼中心肉色和pH值，并对72 ℃的肉饼进行感官品评。本实验共重复三次，每批实验的每个处理条件下均有三个肉饼作为平行。

1.4 pH值的测定

生鲜肉饼pH值：在每个贮藏时间点，用校正后的pH计（采用两点法校正，即pH值为4.00和7.00的缓冲液）直接测定肉饼中心pH值；对于熟制肉饼，测定肉饼冰浴5 min后切面中心位置的pH值。每个肉饼测量3次，取平均值。

1.5 肉色指标的测定

生鲜肉色的测定：参考 Yang等[12]的测定方法，每个贮藏时间点，在打开包装后将肉饼沿中线切开，用便携式积分球分光光度仪直接测定切面的L*值（亮度值）、a*值（红度值）和b*值（黄度值），每个肉饼测定6次，取其平均值。

熟制肉色的测定：立即从煎板取下，装入真空包装袋中置于冰水中冰浴5 min，以防止温度继续上升，冰浴完成后沿中线切开并立即测定其切面中心的L*值、a*值和b*值，每个肉饼测定6次，取其平均值。

1.6 脂质氧化的测定

参考Siu等[13]的测定方法并稍作改动。在各个时间点，从牛肉饼内部称取样品4 g（剔除筋腱和脂肪），加入20 mL蒸馏水混匀，用均质机匀浆1 min（均质30 s间隔30 s再均质30 s）。随后，向均质液中加入20 mL 10%（W/V）的三氯乙酸溶液，混合均匀，经whatman NO.1滤纸过滤，留取滤液备用。取4 mL滤液，加入1 mL 60 mM硫代巴比妥酸溶液混匀，80 ℃水浴加热90 min，结束后取出冷却至室温。吸取250 μL混合液转移至 96孔板中，使用酶标仪测定混合液在532 nm处的吸光度值，最后通过标准曲线（用已知浓度的1,1,3,3-四乙氧基丙烷溶液得出）计算出脂质氧化值，结果表示为mg MDA/kg样品。

1.7 菌落总数的测定

参考 Yang等[12]的测定方法并稍作改动。在各个取样点，随机称取10 g肉饼表面及内部肉样，置于无菌拍打袋中，加入90 mL的8.5%无菌生理盐水（含0.01%蛋白胨），用拍击式均质器拍打60 s。进行一系列梯度稀释后选择2～3个适宜稀释度的样品匀液在琼脂培养基中37 ℃恒温培养48 h后计数，记录下相应的稀释倍数和菌落数量，菌落计数以菌落形成单位（colony forming units，CFU）表示。选取菌落数在30 CFU～300 CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计算菌落总数。菌落总数以logCFU/g样品表示。

1.8 感官品评

参考 Maughan等[14]的方法并做适当修改。选取10位长期从事牛肉品质研究的人员为品评人员，在环境适宜的标准品评间里对各部分实验中煎至中心温度72 ℃的肉饼进行品评。品评指标包括嫩度、多汁性、风味和整体可接受性；打分采用9分制，其中5分为标准限值，具体如表1所示。

表1 熟制牛肉饼感官品评表Table 1 Ratings of sensory evaluation on cooked beef patties

样品准备时，将牛肉饼煎制中心温度达到72 ℃后立即从煎板移走，去除边缘部分，切成2 cm×2 cm的小块，作为品评样品，每个样品用三位数随机编码，在2 min内呈递给品评人员。每位品评人员随机呈递每个处理组的1个样品。品评期间准备室温水和苏打饼干以清除品评期间残留的味道。每部分实验的感官品评均进行了3次。

1.9 数据统计分析

本实验中数据使用SAS软件（9.0版本），进行混合模型分析，结果表示为“平均值±标准差”表示。以添加的天然抗氧化剂、煎制中心温度、贮藏时间以及它们的交互作用为固定因素，肉饼作为随机因素，实验重复数 n=3。使用 SAS的混合模型（MIXED procedure）进行方差分析，差异显著水平为p＜0.05，用Sigmaplot 12.5软件进行作图分析。

2 结果与分析

2.1 pH值

表2 添加葡萄籽提取物和茶多酚对牛肉饼pH值的影响Table 2 Effects of adding grape seed extract and tea polyphenols on pH value of beef patties

通过表2可以看出，处理方式、中心温度和贮藏时间的三因素交互作用对牛肉饼中心pH值影响显著（p＜0.05）。添加葡萄籽提取物会使肉饼的初始pH值显著低于对照组肉饼[15]，茶多酚的添加未影响肉饼的pH值，这与Ozvural等[16]的研究结果相同。经贮藏后，三种处理肉饼的pH值增大至5.55，仍处于正常pH值范围内。加热处理会使肉饼的pH值显著增大，这与Mancini等[17]的研究一致。在贮藏6 d，处理组的肉饼熟制后pH值均增大至5.80及以上，而对照组肉饼的熟制pH值仅为5.74，显著低于处理组（p＜0.05）。而Hollenbeck等[18]则发现，肉饼中脂肪含量的增加会使pH值在加热过程中减小。目前仅知，较高的生肉pH值可以提高肌红蛋白在加热过程中的稳定性，这会对PMB现象具有抑制作用[8]。

2.2 肉色

2.2.1L*值

通过表3可以看出，处理方式、中心温度和贮藏时间的三因素交互作用对牛肉饼中心L*值影响显著（p＜0.05）。随着贮藏时间的延长，三种处理的生肉饼中心L*值均逐渐减小。对照组肉饼的L*值最终降至50以下，而添加茶多酚的肉饼L*值显著高于其他两种处理（p＜0.05）。肉饼在加热过程中L*值持续增大，并且经贮藏处理后，L*值增大的程度更大，最高可达到54.63。Yu等[19]同样发现加热可以使L*值增大，并且猜测，这是由于肉中的蛋白质在加热过程中发生结构变化，导致肉的保水能力下降，而水分的渗出又会增加光反射，导致熟肉的L*值比生肉高。此外，肉中可溶性蛋白的流失也会导致熟肉的L*值增大[20]。

2.2.2a*值

表4 添加葡萄籽提取物和茶多酚对牛肉饼a*值的影响Table 4 Effects of adding grape seed extract and tea polyphenols on a* value of beef patties

a*值是肉色研究中最重要的指标，生肉的a*值表征着肉的红度，直接影响消费者的购买意向，而加热过程中的a*值变化则可以反映肉饼的熟制程度，a*值的降低表示熟肉棕褐色程度的增加。通过表4可以看出，处理方式、中心温度和贮藏时间的三因素交互作用对牛肉饼中心a*值影响显著（p＜0.05）。贮藏过程中，三种处理的生肉饼a*值均逐渐下降，但两种天然抗氧化物处理组显著减缓了a*值的下降。贮藏0 d和3 d时各处理组的a*值差异不显著（p＞0.05），但是贮藏6 d时，两种天然抗氧化物处理组的a*值均显著高于对照组（p＜0.05）。Holman等[2]研究发现，当牛肉的a*值高于14.5时，大多数消费者认为其肉色较好，可以引起消费欲望。本研究中三种处理的生肉饼a*值均高于14.5，表现出良好的肉色，但是对照组已出现显著的下降趋势，这说明两种天然抗氧化物有助于维持肉饼在高氧气调包装条件下的肉色稳定性。

加热处理会使肉饼的a*值下降，此时，肉色也由红色向棕褐色转变，逐渐呈现熟肉色泽。本研究中设置66 ℃为未完全熟制的温度，用66 ℃下的中心肉色衡量褐变程度，而 72 ℃的中心肉色为熟制完全的肉色，当66 ℃的肉色与72 ℃肉色无显著差异时，我们认为此肉饼发生了PMB现象[20,21]。本研究中，对照组肉饼贮藏至6 d，在中心温度达到66 ℃时a*值下降至7.88，与 72 ℃无显著差异（p＞0.05），这说明加热至66 ℃时肉饼已经呈现了熟制完全的色泽，发生了PMB现象。而添加葡萄籽提取物和茶多酚的肉饼在加热至66 ℃时的a*值分别为9.30和9.03，均显著高于72 ℃（p＜0.05）。同时可以发现，在 66 ℃时对照组肉饼的a*值显著低于处理组，这说明添加葡萄籽提取物和茶多酚均能有效抑制高氧气调包装条件下的PMB现象。

抗氧化剂可以使肉中的肌红蛋白保持在亚铁形态，此时肌红蛋白的热稳定性较强，所以在理论上，添加抗氧化剂可以延缓加热引起的肌红蛋白变性而导致的褐变[8,22]。除此之外，添加抗氧化剂还可以抑制牛肉的脂质氧化或者提高牛肉的还原能力，这有助于肉色的稳定。Sepe等[11]在牛肉饼中添加5种合成抗氧化剂，研究发现与对照组相比，所有抗氧化剂均能降低脂质氧化，增加牛肉饼的还原能力，从而抑制PMB现象的发生。Suman等[10]尝试添加壳聚糖来抑制作用PMB现象，结果表明添加壳聚糖可以抑制托盘包装肉饼的PMB现象，但未发现对高氧气调包装肉饼PMB现象的抑制作用。而Mancini等[23]研究发现，乳酸的添加无法抑制牛肉饼的 PMB现象。本研究中使用的两种天然抗氧化剂均可以较好的抑制高氧气调包装肉饼的 PMB现象，这说明不同抗氧化剂的作用机制和抗氧化能力可能存在差异，这点值得进行进一步研究。

2.2.3b*值

处理方式、中心温度和贮藏时间三因素对b*值交互作用不显著（p＞0.05），仅存在各因素的主效应（p＜0.05）。通过图1a可以看出，肉饼的b*值在贮藏过程中由15.70显著降低至13.51。图1b则说明添加葡萄籽提取物和茶多酚可以提高肉饼的b*值。图 1c中，肉饼的中心b*值随着中心温度的升高显著增大，当肉饼熟制后，b*值达到15.57。Sun等[24]研究表明，加热处理会使肉品的b*值升高。虽然目前关于肉品加热过程中b*值变化的研究较少，但b*值正逐渐被用作判断肉品熟制程度的参考指标[25]。

2.3 脂质氧化

TBARS值通常被用于评价肉品的脂质氧化程度[26]，通过图2可以看出，处理方式和贮藏时间的交互作用显著影响肉饼的脂质氧化程度（p＜0.05）。在贮藏过程中，三种处理肉饼的脂质氧化程度均显著增大（p＜0.05），但添加天然抗氧化剂的肉饼显著低于对照组，显著抑制了肉饼贮藏期间的脂质氧化。在第 0 d刚加入天然抗氧化剂时，葡萄籽提取物就表现出显著的抗氧化作用，而此时添加茶多酚的肉饼TBARS值与对照组无显著差异（p＞0.05）。在第3 d时，处理组肉饼的TBARS值为1.31和1.47 mg MDA/kg，与0 d时无显著差异，而对照组肉饼已增大至 3.12 mg MDA/kg。在第6 d对照组的TBARS值达到8.98 mg MDA/kg时，处理组的TBARS值为5.62和5.79 mg MDA/kg，显著低于对照组（p＜0.05），且比对照组分别降低了37.4%和35.5%，这说明两个处理组均抑制了脂质氧化程度的增大。许多研究也发现，葡萄籽提取物和茶多酚均可以提高肉的抗氧化能力，降低脂质氧化程度[15,27-29]。

脂质氧化程度的增大会促进牛肉饼加热过程中PMB现象的发生[7]。Bao等[30]发现脂质氧化程度大的肉饼在加热过程中a*值的下降程度也较大，但未与PMB现象联系。Mancini等[17]向肉饼中添加了琥珀酸盐，发现琥珀酸盐可以降低高氧气调包装肉饼的脂质氧化程度，并且抑制了 PMB现象的发生。这是由于脂质氧化可以促进肉中肌红蛋白氧化，导致热稳定性较差的高铁肌红蛋白大量生成。由于高铁肌红蛋白在55 ℃左右就会发生热变性，产生棕色的高铁血色原，因此生肉中大量积累的高铁肌红蛋白容易导致肉饼在加热过程中发生PMB现象[30]。此外，脂质氧化产物还可以消耗肉中的还原物质，降低还原能力，同样会促进PMB现象的发生[20]。因此，天然抗氧化剂可以通过降低肉中的脂质氧化程度来抑制PMB现象[8]。

2.4 菌落总数

表5 添加葡萄籽提取物和茶多酚对牛肉饼菌落总数（log CFU/g）的影响Table 5 Effects of adding grape seed extract and tea polyphenols on the total viable counts (log CFU/g) of beef patties

微生物可以分解利用肉中的碳水化合物和蛋白质等营养物质进行生长繁殖，产生不良代谢物，最终导致肉品腐败[31]。通过表5可以看出，仅贮藏时间对菌落总数具有主效应（p＜0.05），在贮藏期内肉饼的菌落总数逐渐增加，最大增加至4.34 log CFU/g，但未超过7 log CFU/g的货架期要求[32]。有研究发现，葡萄籽提取物和茶多酚在添加到肉制品后，均有一定的抑菌作用[33,34]。本研究结果中，虽然添加天然抗氧化剂的抑菌效果不显著，但仍可以看出，处理后的肉饼在贮藏过程中的菌落总数始终低于对照组。

2.5 感官品评

表6 贮藏时间对牛肉饼感官品质的影响Table 6 Effects of storage time on the sensory quality of beefpatties

由表6可以看出，添加两种天然抗氧化剂对熟制牛肉饼的各项感官指标影响不显著（p＞0.05），仅贮藏时间对熟制牛肉饼的嫩度、多汁性、风味和接受度影响显著（p＜0.05）。随着贮藏时间的延长，熟制牛肉饼的各项品评得分逐渐下降，但得分始终在5分以上，保持在消费者可以接受的水平。异味是评价肉饼的不良气味，本研究中贮藏时间和添加天然抗氧化剂均未对异味评分产生显著影响。在第6 d，熟肉饼的总体可接受性得分为6.01，属于消费者比较容易接受的水平，这说明添加葡萄籽提取物和茶多酚没有对熟制肉饼的感官品质造成负面效果，也未产生异味。

3 结论

高氧气调包装牛肉饼熟制过程中容易发生 PMB现象。添加0.1 g/kg葡萄籽提取物和0.1 g/kg茶多酚可以显著抑制肉饼贮藏期间的脂质氧化，提高生肉饼贮藏期间的肉色稳定性，并提高了肉饼熟制过程中的红度值，抑制了高氧气调包装包装条件下的PMB现象；同时，两种天然抗氧化剂对熟制牛肉饼的各项感官品评指标无不良影响。在生肉饼护色和肉饼熟制时PMB现象的抑制效果方面两种天然抗氧化物差异不显著。因此，可以通过向牛肉饼中添加0.1 g/kg葡萄籽提取物或0.1 g/kg茶多酚，抑制高氧气调包装牛肉饼加热过程中的 PMB现象并改善生肉饼冷藏过程的肉色稳定性。