新冠病毒的现场可视化LAMP检测及其冷链食品分析应用

刘楠，澹台玮，王芳，徐秦峰

（陕西科技大学食品与生物工程学院，陕西西安 710021）

2019年12月以来，由新型冠状病毒SARS-CoV-2感染引发的疫情已经在全球大面积流行[1,2]。随着疫情的蔓延，许多冷链食品外包装检测出病毒阳性并成为关注的焦点[3,4]。据报道自2020年7月以来，国内新冠肺炎病毒呈阳性事件与食品外包装相关的至少已有10件[5]。各市从境外进口的各种海鲜产品、禽肉等冷冻食品外包装携带新冠肺炎病毒[6]成为了疾病传播新途径，给食品质量安全保障带来了新挑战。同时相关专家证明了新冠肺炎病毒可在冷链外包装上长时间存活，一般冰鲜水产品的运输温度在0～4 ℃、冷冻水产品和冷冻畜禽肉的运输温度在零下18 ℃以下[7,8]，这种运输条件为新冠病毒提供了生存环境。海关总署要求部分海关在不影响正常贸易的情况下，对部分冷链食品开展新冠病毒核酸抽样检验工作。因此快速、高效的现场检验可为抽检工作提供便利。

实时荧光 PCR法是目前各医疗检测机构对新型冠状病毒感染检测的金标准[9,10]，但该方法需要较为昂贵的设备，且对人员操作技术要求较高，因此该方法适用于实验室的检测，不适用于现场快速检测[11]。环介导等温扩增（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）技术因其恒温操作而具有现场检测的条件，同时也具有快速准确的优点，目前已经成为检测病原微生物的重要分子工具。已有文献报道[12-14]，采用钙黄绿素检测LAMP扩增产物，实现了1 h内的新冠病毒的肉眼可视化检测，无需大型仪器设备。但由于钙黄绿素分子不稳定，并且其stoke’s位移较小，蓝光激发时显示绿色荧光，存在颜色变化不够明显等问题。20世纪90年代初期，Barton课题组[15]发现了[Ru(phen)2dppz]2+对双链 DNA 的分子的“光开关”效应，Ru(II)配合物水溶液本身不发光，当加入 dsDNA分子时会发光，具有优良的水溶性和稳定性，Stoke’s位移大，通过蓝光激发光观察，呈现红色荧光，相较于传统LAMP染料的绿色荧光，颜色区分更明显，结果更易判定[16-27]。

本研究建立了一种基于环介导等温扩增 LAMP技术和金属 Ru(II)配合物染料相结合的新型冠状病毒可视化闭管检测方法。通过保温杯和蓝光手电代替实验室用电的恒温水浴锅和蓝光透射仪，开发了一种现场快速可视化LAMP检测试剂盒。该方法可为新型冠状病毒的食品现场检验工作提供一种快速、经济、便捷的工具，同时也可应用于医疗、环境、食品卫生等其他领域。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

MyGo Pro荧光定量PCR仪，IT-IS Life Science；PowerPacTM Basic琼脂糖水平电泳仪，BIO-RAD；保温杯，HUAWEI HiLink；蓝光手电筒，AloneFire；MYSPIN12微型离心机，Thermo Fisher Scientific。

1.2 实验试剂

钌(II)配合物[Ru(phen)2dppz]2+试剂，Jena Bioscience公司；dNTP混合液、Solution Mix、MgSO4、Bst 2.0 WarmStar® DNA 聚合酶、100×TE Buffer均来自New England Biolabs；甜菜碱，Sigma公司；(20×)EvaGreen，Biotium公司；PCR反应mix（KT201）、DNA MarkerII、TRNzol Universal总RNA提取试剂盒、FastKing RT Kit（KR116），天根生化科技（北京）有限公司；琼脂糖（Biotech Grade）、新冠病毒N基因质粒、MERS病毒质粒、金黄色葡萄球菌质粒、阪崎肠杆菌质粒以及新冠病毒假病毒，均来自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 引物的设计与合成

本研究针对新型冠状病毒基因在NCBI网站中登记号为MN908947的信息，选定新冠N基因对应序列，同时依据引物设计原则使用PrimerExplorerV5在线设计LAMP引物，包括外引物F3、B3和内引物FIP、BIP。根据T/CAQI 159-2020食品及食品包装表面中新型冠状病毒采样与实时荧光 RT-PCR检测方法选取PCR引物序列，包括正向引物（F）、反向引物（R）和双标记荧光探针（P）。选引物序列见表1。

表1 实验所用引物及探针序列Table 1 Primers and probe used in the experiment

1.4 LAMP体系的建立

LAMP 反应体系为 10 μL，包括：1 μL 10× Thermol Pol buffer，外引物 F3 和 B3（4 μmol/L）各 0.25 μL，内引物FIP和BIP（50 μmol/L）各0.16 μL，1.4 μL dNTPs（10 mmol/L），1.6 μL 甜菜碱（0.8 mol/L），0.45 μL MgSO4（100 mmol/L），0.4 μL BstDNA 聚合酶（8 U/μL）。阳性体系添加DNA模板1.2 μL，以双蒸水代替DNA作为阴性对照，最后用水补齐到10 μL。钌(II)配合物[Ru(phen)2dppz]2+添加至反应管内的吸头内[28]。将反应管密封，放置于保温杯中，调节保温杯温度至65 ℃，恒温扩增反应40 min，反应结束后倒置混匀，使反应产物与[Ru(phen)2dppz]2+结合并混匀，最后在蓝光手电下进行目视观察比色、分析。阳性结果在蓝光激发下显示红色，阴性结果无色。具体步骤见图1。

1.5 可视化现场检测试剂盒的可行性

添加0.25 μL Eva Green（20×）至反应体系中，使用MyGo仪进行实时恒温LAMP反应观察实时荧光扩增曲线，验证引物进行LAMP扩增反应的可行性。将在保温杯中65 ℃下进行LAMP恒温反应40 min扩增的反应管取出，通过蓝光手电观察离心管荧光颜色，用手机拍取荧光照片，并使用荧光光谱仪扫描光谱，最后采用 2%的琼脂糖凝胶进行确认在保温杯中进行了LAMP反应。

1.6 可视化LAMP方法的灵敏度与特异性

将 1.79×106copies/μL的新型冠状病毒质粒按照10 倍浓度梯度依次稀释为 1.79×106、1.79×105、1.79×104、1.79×103、1.79×102、1.79×101、1.79×100copies/μL并设置空白对照，每个梯度均取1.2 μL为模板，验证方法的灵敏度。

应用构建好的LAMP可视化检测方法，以目标病毒（新型冠状病毒质粒）为阳性模板，以非目标（MERS病毒、金黄色葡萄球菌、阪崎肠杆菌）的质粒，分别作为待测样品模板，双蒸水作为阴性对照（NTC）进行特异性验证。反应结束后，通过蓝光激发光观察颜色变化。

1.7 人工污染冷链食品中新冠病毒的检测

以新冠病毒假病毒人工污染冰淇淋，作为模拟冷链食品样品。然后通过TRNzol Universal总RNA提取试剂盒提取RNA，再通过FastKing RT Kit（KR116）试剂盒反转录为DNA，以反转录产物作为模板，进行人工污染冷链食品中新型冠状病毒的可视化 LAMP和实时荧光定量 PCR检测。荧光定量 PCR：5 μL KT201，正向引物（4 μmol/L）、反向引物（4 μmol/L）、荧光探针（4 μmol/L）各1 μL，最后用双蒸水补齐到10 μL。采用两步扩增，95 ℃-5 min，95 ℃-10 s，55 ℃-45 s，共35个循环。

2 结果与讨论

2.1 可视化LAMP检测方法的可行性

采用实时荧光PCR仪，进行恒温LAMP反应，结果如图2a所示，在模板存在时能够观察到明显的扩增曲线，证明引物能够进行LAMP扩增反应。同时在保温杯中进行的LAMP扩增反应，其扩增产物的琼脂糖凝胶电泳，可清晰显示出LAMP扩增条带（图2a），表明在保温杯中可以进行LAMP反应。同时在蓝光手电照射下，阳性反应管发射出明显的红色荧光信号，如图2b所示；无模板存在时，无荧光发射，所观察到的反应管的荧光颜色与荧光光谱信号强度保持一致。表明钌(II)配合物[Ru(phen)2dppz]2+可用于LAMP扩增反应的可视化检测。相比于常见的钙黄绿素stoke’s位移约为40 nm[13]，本实验中的[Ru(phen)2dppz]2+试剂的stoke’s位移则大于150 nm，采用蓝光激发时发射处于红色荧光区，颜色区分更为明显，可减少目视观察的主观性误差。

2.2 可视化 LAMP检测方法的灵敏度与特异性检验

新型冠状病毒质粒的灵敏度检验结果如图 3a所示，通过使用缓冲液对质粒进行10倍梯度稀释，在8号反应管空白对照显示阴性的情况下，新冠病毒浓度在1.79×106copies/μL 至1.79×100copies/μL中检测结果均为阳性。因此LAMP可视化检测方法对新型冠状病毒的检测灵敏度为单个拷贝数。

针对新型冠状病毒质粒、MERS病毒质粒、金黄色葡萄球菌质粒、阪崎肠杆菌质粒DNA进行LAMP扩增，采用超纯水作为空白对照。检测结果如图 3b所示，含有新冠病毒质粒的可视化LAMP检测结果为阳性，而对于其他病毒和食源性病原菌以及空白对照的扩增结果均为阴性。因此证明该LAMP可视化检测方法对新冠病毒有引物特异性。

2.3 人工污染冷链食品中新冠病毒的检测结果

以新冠假病毒人工污染冷链食品，同时进行可视化LAMP扩增检测与实时荧光PCR检测，验证方法的实用性。如图4a和4b所示，新冠假病毒阳性对照和新冠假病毒人工污染的冰淇淋样品，均在Ct值24左右出现典型的扩增曲线，同时反应管中出现明显的红色荧光，冰淇淋阴性对照则无明显的扩增曲线和红色荧光出现，证明该方法可应用于冷链食品中新冠病毒的检测。

3 结论

本研究建立的基于Ru(II)配合物[Ru(phen)2dppz]2+染料的闭管可视化检测LAMP扩增新冠病毒的方法，反应温度为62 ℃，反应时间仅需40 min，其检出性能与实时荧光定量PCR法相持平，可检测到模板浓度为单个拷贝数，并与MERS病毒、金黄色葡萄球菌、阪崎肠杆菌之间无交叉反应，具有较高的特异性。无需实验室的精密操作与仪器，仅利用保温杯和蓝光手电筒可进行现场可视化目视检测，成本低、高效快速。该方法可以为食品新冠检测筛查提供支持，适合在资源有限场所开展核酸检测或者家庭自检。