白藜芦醇对体外培养的水牛卵丘细胞增殖活力及其相关基因mRNA表达的影响

郑海英，杨春艳，李玲玉，唐丽萍，郑 威，尚江华

(中国农业科学院广西水牛研究所，农业农村部水牛遗传繁育技术重点实验室，南宁 530001)

卵丘细胞是卵母细胞周围的一种颗粒细胞，具有维持卵母细胞减数分裂停滞状态，帮助诱导减数分裂恢复和促进细胞质成熟等特殊的生理功能。卵丘细胞的增殖、扩展和凋亡会影响卵母细胞成熟、受精及后续早期胚胎的发育。卵丘-卵母细胞在体外成熟培养过程中易受外界环境影响，细胞内氧化-抗氧化系统平衡易被打破，引起卵丘-卵母细胞内产生过多的活性氧(ROS)，使卵丘-卵母细胞遭受氧化损伤，进而影响卵母细胞体外成熟并降低胚胎体外生产效率[1]。白藜芦醇(resveratrol，RES)属非黄酮类多酚化合物，是一种天然植物抗毒素，存在于花生、葡萄、紫斑牡丹、桑椹和虎杖等多种植物中，RES具有抗氧化、抗肿瘤[2]、抗炎[3]、抗凋亡[4]和抗衰老[5]等多种生物活性。RES通过影响卵母细胞膜和氧化体系来清除自由基，调节卵母细胞周期、增殖和凋亡相关基因的表达，提高胚胎发育潜能[6]。研究发现，0.5 μmol/L RES能提高绵羊卵丘细胞的扩展和孕酮(P4)的浓度，并减少卵母细胞内ROS含量，增强了卵母细胞抗氧化能力以促进卵母细胞体外成熟[7-8]。邢鹏等[9]研究发现，50 μmol/L RES显著提高了人卵泡颗粒细胞抗凋亡基因B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)表达量，降低了凋亡标记基因半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)表达量，从而增强了颗粒细胞的抗凋亡能力，但添加10 μmol/L RES则无显著差异。Wang等[10]研究发现，1 μmol/L RES能够提高牛卵丘细胞扩展和卵丘细胞P4分泌量，并通过调节牛卵母细胞抗氧化酶相关基因的表达，促进卵母细胞成熟。在猪上的研究发现，添加2 μmol/L RES显著下调了Caspase-3和促凋亡基因Bcl-2相关蛋白(Bax)的表达，抑制了卵母细胞凋亡[11]。同时Li等[12]研究发现，添加2 μmol/L RES维持了猪卵母细胞内超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)等抗氧化酶在一个平衡状态。另外研究显示，成熟液中添加1 μmol/L RES，同样能够提高小鼠卵母细胞内CAT和超氧化物歧化酶1(SOD1)的表达，改善卵母细胞的质量[13]。在氧化应激状态下，10 μmol/L RES显著下调小鼠心肌及内皮细胞p21蛋白表达量，延缓了细胞衰老[14]。目前，关于RES对水牛卵丘-卵母细胞体外成熟的影响及其作用尚不明确。因此，本试验以水牛卵丘细胞为研究对象，探究添加RES对卵丘细胞活力、激素分泌及卵丘扩展相关基因(透明质酸合酶2(HAS2)、穿透素3(PTX3)、前列腺素内过氧化物合酶2(PTGS2))、凋亡相关基因(Bcl-2、Bax、Caspase-3、细胞周期蛋白激酶抑制因子(p21))和抗氧化酶相关基因(SOD1、CAT)表达的影响，为研究RES对水牛卵母细胞成熟及发育的作用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 卵巢采集 试验所用水牛卵巢取自南宁市某屠宰场。采集的水牛卵巢放入含有双抗、温度为25～30 ℃的生理盐水保温杯中，在2～3 h 送回实验室。

1.1.2 主要试剂 DMEM培养基和胎牛血清(FBS)均购自Gibco公司；实时荧光定量PCR试剂SYBR®Premix ExTaqTM购自宝生物工程(大连)有限公司；雌二醇(E2)和P4ELISA试剂盒均购自江苏酶标生物科技有限公司；白藜芦醇、二甲基亚砜(DMSO)、青霉素、链霉素、磷酸缓冲液(PBS)、胰蛋白酶、透明质酸酶均购自Sigma公司。

RES浓储液配制：使用DMSO溶解白藜芦醇，配制20 mmol/L的浓储液。

1.2 方法

1.2.1 水牛卵丘细胞的收集与培养 用10 mL注射器穿刺抽吸卵巢上4～8 mm大小卵泡的卵泡液。在体视显微镜下用捡卵针挑选细胞质均匀、包裹有2层以上卵丘细胞的卵丘-卵母细胞复合体(cumulus oocyte complexes,COCs)，用PBS液清洗3次，转入0.1%透明质酸酶中消化并用移液枪反复吹打使卵丘细胞与卵母细胞完全分离，挑出裸露的卵母细胞。用1.5 mL离心管收集卵丘细胞混悬液，2 500 r/min离心5 min，弃上清后用DMEM培养液离心洗涤2次。将收集的卵丘细胞接种于细胞培养板中培养(培养液为：DMEM培养基+10%FBS+100 U/mL青霉素+100 μg/mL链霉素)，24 h细胞开始贴壁生长。培养2～3 d，贴壁细胞达到50%～60%汇合度即可进行添加白藜芦醇分组试验：以DMEM+10% FBS为基础液，将RES浓储液配制成1、10、20、30、40、50、60 μmol/L的培养液，以不加RES(0 μmol/L)为对照组。 所有试验均重复3次。

1.2.2 细胞活力测定 将水牛原代卵丘细胞调整为105/mL,以每孔100 μL接种到96孔细胞培养板中，在37 ℃、5% CO2、100%饱和湿度的培养箱中培养至细胞汇合度达50%时，弃去原培养液，添加0(对照组)、1、10、20、30、40、50、60 μmol/L的RES继续培养12、24、36、48及60 h时，分别更换新培养液100 μL和CCK-8 10 μL，于培养箱中继续孵育4 h后，采用酶标仪测定吸光度，测定波长为450 nm。每组设3个复孔。 以只加培养液的孔为空白组。 细胞活力(%)=(D处理组-D空白组)/(D对照组-D空白组)×100。通过检测各组的细胞活力筛选最佳RES浓度及处理时间进行后续试验。

1.2.3 细胞培养液中激素含量检测 对照组和最佳RES浓度组水牛卵丘细胞培养36 h后，用移液枪吸取细胞上清液，采用ELISA法测定E2和P4的含量。

1.2.4 总RNA提取、反转录及实时荧光定量PCR检测 对照组和最佳RES浓度组水牛卵丘细胞培养36 h后，用PBS清洗3次，用微量RNA提取试剂盒提取水牛卵丘细胞总RNA，经反转录合成cDNA。然后根据GenBank中牛HAS2、PTX3、PTGS2、Bcl-2、Bax、Caspase-3、SOD1、CAT和p21基因的参考序列，利用NCBI Primer Blast设计引物(表1)，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以β-actin为内参基因，以cDNA为模板，用实时荧光定量PCR检测各基因的表达。PCR反应体系15 μL：SYBR®Premix ExTaqTMⅡ7.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.3 μL，cDNA 1.0 μL，ddH2O 5.9 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min。每个样品设置3个重复，用Roche LightCycler 480采集荧光信号并分析，用2-△△Ct方法计算各目的基因的相对表达量。

表1 引物信息

续表

1.3 统计分析

用SPSS 20.0统计软件对数据进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)，采用Duncan’s法进行多重比较，结果用平均值±标准差表示，用GraphPad Prism 5.0软件进行绘图。P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结 果

2.1 RES对水牛原代卵丘细胞增殖活力的影响

由表2可知，与对照组相比，在体外培养24～36 h内，1、10和20 μmol/L RES组水牛卵丘细胞的增殖活力均有升高趋势，在培养36 h时，10 μmol/L RES组细胞活力显著高于对照组(P<0.05)，1和20 μmol/L RES组与对照组差异不显著(P>0.05)。但培养36 h后，随着添加时间的延长，细胞增殖活力呈逐渐下降趋势，且40、50和60 μmol/L RES组无论作用时间长短，细胞活力均显著低于对照组(P<0.05)，抑制卵丘细胞生长。10 μmol/L RES组细胞活力最强，因此，选择10 μmol/L RES为后续试验的最佳添加浓度。

表2 不同浓度RES组水牛原代卵丘细胞的增殖活力

2.2 RES对水牛原代卵丘细胞E2和P4分泌的影响

由图1可知，与对照组相比，10 μmol/L RES组水牛卵丘细胞E2和P4分泌量均显著高于对照组(P<0.05)。

与对照组相比，*，差异显著(P<0.05)；**，差异极显著(P<0.01)；无*，差异不显著(P>0.05)。下同Compared with control group, *, Significant difference (P<0.05)；**，Extremely significant difference (P<0.01)；No *, No significant difference (P>0.05). The same as below图1 RES对水牛原代卵丘细胞E2、P4分泌的影响Fig.1 Effects of RES on E2 and P4 secretion of buffalo primary cumulus cells

2.3 RES对水牛原代卵丘细胞扩展、凋亡和抗氧化相关基因表达的影响

实时荧光定量PCR检测结果表明，与对照组相比，10 μmol/L RES组卵丘细胞扩展相关基因PTX3、抗凋亡基因Bcl-2、抗氧化基因SOD1的mRNA表达量均显著增加(P<0.05)，PTGS2基因表达量极显著增加(P<0.01)，HAS2和CAT基因表达量均无显著差异(P>0.05)；促凋亡基因Bax、p21和Caspase-3的表达量极显著或显著降低(P<0.01；P<0.05)(图2)。

图2 RES对水牛原代卵丘细胞HAS2、PTX3、PTGS2、Bax、Bcl-2、Caspase-3、SOD1、CAT及p21基因相对表达量的影响Fig.2 Effects of RES on the relative expression of HAS2,PTX3,PTGS2,Bax,Bcl-2,Caspase-3,SOD1,CAT and p21 genes of buffalo primary cumulus cells

3 讨 论

卵丘细胞作为卵母细胞周围的一种颗粒细胞，在卵泡发育和成熟卵泡排卵或闭锁过程中发挥着重要作用，且颗粒细胞分化、增殖及其与卵母细胞之间的信号交流决定着卵母细胞的命运。同时卵巢颗粒细胞是雌性动物体内重要的类固醇激素分泌细胞，可合成并分泌E2和P4及其他一些细胞因子，这些类固醇激素对于雌性动物的正常生理节律和妊娠过程均至关重要。本研究发现，不同浓度RES对水牛卵丘细胞的增殖活力及E2和P4分泌有一定影响，体外培养36 h内低浓度RES促进细胞增殖，36 h后细胞增殖能力逐渐下降。而无论培养时间长短，高浓度RES均抑制卵丘细胞增殖。在培养36 h，10 μmol/L RES条件下，卵丘细胞增殖能力最强，卵丘细胞E2和P4分泌量增加。Ortega等[15]在大鼠上的研究显示，10和30 μmol/L RES对颗粒细胞培养24和48 h的P4分泌量无显著影响，同时随浓度的升高显著降低E2分泌量及芳香化酶基因(CYP19)的表达。Basly等[16]研究MFC-7细胞发现，10和25 μmol/L RES表现出E2兴奋性作用，而0.1和1 μmol/L则表现出抗E2样作用。本研究结果与上述10 μmol/L RES的研究结果不一致，可能与添加RES培养时长和细胞类型不同有关。而与在绵羊[7]和牛[10]上细胞E2分泌量降低结果正好相反，推测RES是通过正反馈作用促进水牛卵丘细胞E2的分泌。因为RES既可作为一种选择性的E2受体调节剂,也可作为芳香化酶的抑制剂，在不同的动物试验中表现出不同程度的E2受体激动剂活性[17]，并竞争性地与卵丘细胞上的E2受体结合，当卵丘-卵母细胞的E2受体达到饱和状态，便会通过负反馈作用调节降低卵丘细胞E2的分泌量。

本试验检测卵丘细胞扩展、凋亡和抗氧化相关基因的mRNA表达量发现,10 μmol/L RES能显著上调水牛卵丘细胞PTX3、PTGS2、Bcl-2和SOD1基因的表达量，显著下调Bax、Caspase-3和p21基因的表达量。卵丘细胞扩展依靠相关基因的参与，以保证卵丘细胞的完整、扩展及卵母细胞的成熟。卵丘细胞的扩展程度是评价卵母细胞成熟及其质量的关键指标之一，卵丘扩展相关基因HAS2、PTGS2和PTX3促进卵丘细胞的增殖和扩展[18]。HAS2主要参与卵丘细胞外基质透明质酸酶的合成，PTGS2参与相关激素的信号转导途径，PTX3在卵丘细胞外基质的组织中起关键作用[19]。研究发现，体外成熟培养液中添加2 μmol/L RES可提高猪的卵丘细胞扩展、极体形成及调节卵母细胞成熟过程中的基因表达[11]。RES作为一种抗氧化剂，具有很强的活性氧清除能力，能够清除氧自由基和羟自由基，并通过调节与细胞凋亡有关基因的表达，可减少细胞凋亡[20]。本研究结果与人卵泡颗粒细胞添加50 μmol/L RES的研究结果基本一致，但与添加10 μmol/L RES的结果不同[15]。Kwaka等[11]研究发现，添加2 μmol/L RES对猪卵母细胞Bcl-2基因的表达无显著影响，但明显下调了Caspase-3和Bax基因的表达，抑制了卵母细胞凋亡。该研究结果与在牛[17]和山羊[21]卵母细胞研究的结果一致。然而，在人乳腺癌细胞体外培养中发现RES存在剂量依赖效应，低浓度促进细胞分裂、抑制细胞凋亡，高浓度则抑制细胞增殖、促进细胞凋亡[22]。另外对在猪卵母细胞研究显示，添加10 μmol/L的RES时，Bax基因表达量升高，Bcl-2基因表达量下降，细胞呈现凋亡状态，Bcl-2基因表达量甚至低于对照组[23]。 这与Lee等[24]和Torres等[17]添加高浓度RES所得研究结果类似，但与本研究添加10 μmol/L的RES研究结果恰好相反，推测这可能与不同物种、不同细胞类型、不同的细胞培养基成分及添加后培养时长差异有关。体外培养过程中会产生氧化应激从而导致卵丘-卵母细胞的衰老和死亡，而抗氧化酶对于机体的抗氧化能力起到重要的作用。大量的体外研究表明，添加一定浓度的RES，细胞内的ROS水平明显降低，能够缓解多种因素诱导的氧化应激[25]。对小鼠和猪的研究发现，添加一定浓度的RES显著提高了卵母细胞CAT、SOD1和Bcl-2基因的表达量，维持了猪卵母细胞内SOD和CAT等抗氧化酶基因在一个平衡状态，从而改善卵母细胞的质量[12-13，23]。当细胞受到氧化应激时，细胞周期异常调控会导致细胞增殖失控等细胞正常功能异常发生。p21基因是抑癌基因，具有诱导细胞周期阻滞、促进细胞衰老和凋亡等功能，p21在细胞凋亡、分化方面具有重要作用。研究发现，氧化应激状态下，10 μmol/L RES显著下调小鼠心肌及内皮细胞p21蛋白量，延缓了衰老[14]。Liang等[26]对中年小鼠注射RES可以有效改善氧化应激引起的输卵管卵母细胞衰老。本研究结果显示，10 μmol/L RES显著上调SOD1基因的表达量，下调p21基因的表达量，与上述研究结果基本一致。

4 结 论

本试验结果表明，添加10 μmol/L RES体外培养36 h能够显著提高水牛卵丘细胞增殖活力，促进卵丘细胞分泌E2和P4，显著促进水牛卵丘细胞扩展相关基因(PTX3、PTGS2)、凋亡抑制基因Bcl-2和抗氧化基因SOD1的相对表达，并显著降低促凋亡基因Bax、Caspase-3和p21的表达。 说明10 μmol/L RES能够促进水牛卵丘细胞增殖和扩展，提高卵丘细胞抗氧化能力的同时减少细胞凋亡，并参与水牛卵丘细胞激素分泌的调节。