Nrf2/Keap1-ARE通路的生物学功能及其信号调控

冯志强，王腾飞，赵善江，郝海生，杜卫华，赵学明，邹惠影，朱化彬，庞云渭

(中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100193)

氧化还原平衡的维持是机体或细胞发挥正常生理功能的基础。当机体受到外界各种有害刺激时，体内产生的氧自由基或活性氧(reactive oxygen species，ROS)会超过自身的清除能力，过量的ROS破坏机体内氧化和抗氧化的平衡稳态，造成DNA损伤，引发氧化应激。随着中国集约化畜禽养殖业的快速发展，高温高湿、有害气体、高脂高蛋白饲粮等因素都会引起动物的氧化应激，导致畜禽抗病能力下降，严重阻碍畜禽健康生长和生产性能的提高。核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2 related factor，Nrf2)/Kelch样ECH相关蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1)-抗氧化应答元件(antioxidant response element，ARE)信号通路是近年来发现的机体内源性抗氧化信号途径。由Nfe2l2基因编码的Nrf2是一种重要的核转录因子，可调控下游300多个靶基因的表达[1]。Keap1是Nrf2的胞质抑制因子，发生氧化应激时，Keap1上的关键“传感器”半胱氨酸巯基被修饰，破坏其对Nrf2的降解，游离和新生的Nrf2易位到细胞核内，与小Maf(small Maf，sMaf)蛋白形成异二聚体并识别ARE序列，开启基于Nrf2的细胞保护系统[2-3]。Nrf2/Keap1-ARE通路可参与包括维持细胞内氧化还原平衡、细胞增殖/分化、代谢、蛋白质稳态和炎症的调节以及疾病的发生发展等多种细胞过程[4-5]。以下主要就Nrf2/Keap1-ARE信号通路的分子结构基础、生物学功能及Nrf2信号的调控机制作一简要综述，为缓解氧化应激损伤、提高畜禽生产性能提供理论基础。

1 Nrf2/Keap1-ARE通路的分子结构

1.1 Nrf2的结构

Nrf2是一种具有保守碱性亮氨酸拉链结构(basic-region leucine zipper，bZIP)的cap “n” collar(CNC)转录因子，含有7个Nrf2-ECH同源结构域(Nehl～Neh7)[6](图1，参考相关文献[7]绘制)。Nehl结构域包含CNC-bZIP区，与细胞核内sMaf蛋白形成异二聚体，识别并结合ARE上的DNA分子，也可与E2泛素连接酶UbcM2相互作用，调节Nrf2蛋白的稳定性[8]。Neh2结构域含有DLG和ETGE两个高度保守的氨基酸基序，介导Nrf2负调控因子Keap1与赖氨酸残基相互作用[9]。Neh3位于Nrf2的C端，与转录辅激活因子CHD6相互作用，负责染色质重塑后ARE调控相关基因的反式激活[10]。Neh4和Neh5属于转录激活结构域，不仅可与辅激活因子环磷酸腺苷应答元件结合蛋白(cAMP-responsive element-binding protein，CREB)结合促进Nrf2转录，还可与核辅因子RAC3/AIB1/SRC3相互作用，增强ARE下游基因的表达[11]。Neh6结构域是一段富含丝氨酸的非依赖Keap1的负调控Nrf2稳定性的区域，包含DSGIS和DSAPGS两个保守的肽基序，这两个基序能够被β-转导重复序列蛋白(β-TrCP)识别；在糖原合成激酶3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)介导DSGIS基序磷酸化后，β-TrCP结合到Neh6结构域，促进泛素连接酶复合物募集和Nrf2蛋白酶体降解[12-13]。Neh7通过与视黄醇类X受体α相互作用，抑制Nrf2的转录活性[14]。

图1 Nrf2蛋白结构域Fig.1 The protein domain of Nrf2

1.2 Keap1的结构

Keap1是一种分子质量为69 ku的蛋白，包含5个结构域，分别为NTR、BTB/POZ、IVR、DGR和CTR结构域[15-16](图2，参考相关文献[7]绘制)。NTR和CTR区分别为N-末端结构域和C-末端结构域。BTB/POZ区与肌动蛋白结合蛋白结合形成同源二聚体，在E3泛素连接酶的作用下参与Nrf2的泛素化和降解[17]。IVR结构域富含半胱氨酸残基，对亲电试剂和氧化剂敏感，在发生氧化应激时，IVR构象改变，导致Nrf2与Keap1解离；IVR区还包含一个核输出信号基序，对Keap1在胞质中的定位至关重要[17]。DGR结构域又称Kelch结构域，DGR与CTR共同形成六叶β-螺旋结构，直接与Nrf2-Neh2区的DLG和ETGE基序结合，使Keap1二聚体能够识别一个Nrf2分子[15]。

图2 Keap1蛋白结构域Fig.2 The protein domain of Keap1

1.3 ARE的结构

ARE是具有5′-TGACXXXGC-3′核心序列的特异DNA启动子序列，最初被鉴定为NADPH醌脱氢酶1(NADPH quinone dehydrogenase 1，NQO1)和谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione S-transferase，GST)基因的顺式调控元件。随后的研究发现，ARE编码的基因涉及药物解毒、抗氧化反应、NADPH再生和代谢调节等一系列过程[18]，包括超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GPx)、谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase，GR)、谷氨酸-半胱氨酸连接酶(glutamate-cysteine ligase，GLC)、血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)、硫氧还蛋白(thioredoxin，TXN)、硫氧还蛋白还原酶1(thioredoxin reductase 1，Txnrd1)等。Nrf2是ARE最重要的激活因子，在应激条件下，Nrf2与Keap1解离，转位到细胞核内，与sMaf 蛋白形成异二聚体并识别ARE序列，激活下游细胞保护基因的转录，即Nrf2/Keap1-ARE通路(图3，参考相关文献[19]绘制)。Nrf2退化或受抑制会使细胞变敏感，易受氧化损伤[17]。

图3 Nrf2/Keap1-ARE信号通路在生理(A)和应激(B)状态下的调控Fig.3 Regulation of Nrf2/ Keap1-ARE signaling pathway in physiological (A) and stress (B) states

2 Nrf2/Keap1-ARE通路的生物学功能

2.1 维持胞内氧化还原平衡及代谢稳态

Nrf2/Keap1被认为是“巯基驱动的主开关”，一方面通过调节GR、GPx和GST等的表达，维持胞内还原型GSH的水平[18]；另一方面通过调控胞质TXN、Txnrd1等的表达，提供ROS产生的区域性传感和信号转导[20-21]，在维持细胞氧化还原稳态中发挥重要作用。 Nrf2诱导剂莱菔硫烷(sulforaphane,SFN)不仅可增强氧化应激环境下牛颗粒细胞的活力，降低细胞毒性，上调Nrf2下游靶基因(CAT、PRDX1、SOD1和TXN1)表达[22]；还可保护精子抵抗冷冻-解冻氧化损伤，减少对精子的不利影响[23]。热应激导致的奶牛产奶量下降和乳腺功能障碍是乳制品行业面临的重大难题，Yang等[24]研究发现，热应激显著增加了牛乳腺上皮细胞内ROS积累和丙二醛含量，降低了SOD和GPx活性，而胆碱处理可通过调节PERK/Nrf2信号通路有效抑制热应激诱导的乳腺上皮细胞氧化应激和凋亡，研究结果为缓解奶牛热应激和改善其繁殖性能提供了参考。

此外，Nrf2可调节编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、苹果酸酶1和柠檬酸脱氢酶1等基因的表达，参与NADPH的再生[25]，影响磷酸戊糖途径(pentose phosphate pathway，PPP)。5-磷酸核糖是PPP的主要产物，可代谢为嘌呤或嘧啶核苷的前体——磷酸核糖焦磷酸。研究发现，Nrf2通过间接调控磷酸核糖焦磷酸氨基转移酶和亚甲基四氢叶酸脱氢酶2来促进嘌呤的合成[25]。在脂质代谢中，Nrf2通过调节线粒体内肉碱棕榈酰转移酶和酰基辅酶A来控制脂肪酸氧化的效率[25]。铁作为一种必需的营养物质，被用作氧气运输、氧化磷酸化和代谢产物氧化酶的辅助因子[26]，但是过量的铁会促进ROS生成，破坏生物分子。Nrf2通过调控NQO1、HO-1和胆绿素还原酶(biliverdin reductase，BVR)基因的表达，参与血红素和铁的代谢[27]。

2.2 抗炎抗衰老作用

Nrf2调节的抗氧化和细胞保护酶能防止亲电氧化损伤和抑制促炎症介质的过度生成[28]。沉默Nrf2后，环氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNFα)的表达显著增加[29]；而激活Nrf2则会降低COX-2和iNOS的表达，表明Nrf2对促炎症介质具有抑制作用[30]。妊娠期奶牛易受致病菌感染，导致子宫内膜炎。在用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的牛乳腺上皮细胞炎症反应模型中，研究人员发现，LPS可造成乳腺上皮细胞损伤和凋亡[31]。Gao等[32]用桃叶珊瑚甙处理LPS诱导的牛子宫内膜上皮细胞，发现桃叶珊瑚甙能降低子宫内膜上皮细胞中TNFα、IL-1β、IL-6、COX-2和iNOS mRNA的表达，激活Nrf2/Keap1通路，促进Nrf2核转移，并提高Keap1、Nrf2、HO-1和NQO1的mRNA和蛋白表达水平，说明Nrf2/Keap1通路对牛子宫内膜上皮细胞具有保护作用。非瑟酮是一种天然的多酚类黄酮，具有多种药理活性。最新的研究发现，非瑟酮也可通过激活Nrf2/HO-1通路有效抑制LPS诱导的氧化应激和炎症反应[33]。

在多种细胞类型中，Nrf2的表达水平和活性均随年龄的增长而下降[34]，通过Nrf2激动剂SFN增强Nrf2活性和内源性细胞保护机制是预防衰老引起的肌肉和心脏功能障碍的有效手段[35]。Nrf2/Keap1途径激活还能够延缓或逆转Ⅱ型糖尿病对胰腺、心脏、皮肤以及其他细胞和组织造成的损伤[36]。Nrf2基因沉默抑制内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)的迁移、增殖和分泌，加剧其氧化应激水平和衰老；而激活Nrf2可保护EPCs免受氧化应激和细胞衰老的影响，改善糖尿病小鼠EPCs的生物学功能[37]。

2.3 对疾病的调控作用

Nrf2/Keap1-ARE通路的激活是抗肿瘤发生的重要机制之一。在肿瘤发生早期，Nrf2的激活使癌细胞能够适应不利的微环境和高内源性ROS水平[27]；而在快速增殖的细胞中，Nrf2可通过促进核苷酸和氨基酸的生物合成来支持中间代谢[38]。Keap1的功能缺失性突变或Nrf2的功能获得性突变是非小细胞肺癌和环境因素诱发的其他癌症的重要病因[39]。Nrf2的活化增强了抗肿瘤免疫，从而防止肺癌的发生，但在肿瘤发生后却能加速其生长[40]。与野生型小鼠相比，化学致癌的Nrf2基因敲除小鼠肿瘤数量明显增多，但体积显著减小[41]。这些结果表明，低活性Nrf2促进肿瘤发生，而持续的高活性Nrf2可加速癌症进展及对治疗的耐受。

已有研究证实，Nrf2能够降低帕金森病(Parkionson’s disease,PD)、阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)等疾病的发生。Lewy小体是PD患者脑内的特征性标志物，其主要成分是α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)，编码α-syn的SNCA基因的三倍化引起α-syn的过量表达，促进Lewy小体的形成；Nrf2通过清除α-突触核蛋白，阻止Lewy小体的形成和PD的发生[42]。β-淀粉样多肽(amyloid-β peptides,Aβ)沉积是AD发病机制中的关键事件，在AD动物模型中，Nrf2活化可降低Aβ生成限速酶BACE1的产生并改善认知缺陷[43]。动物研究和临床试验发现，Nrf2/Keap1途径在Ⅱ型糖尿病及其并发症的发生发展中起着重要的防御作用[44]，如敲除Nrf2的胰岛β细胞抗氧化酶水平降低，而过表达Nrf2可诱导β细胞的增殖[45-46]。

3 Nrf2信号的多层调控

Nrf2处于复杂调控网络的中心，其活性可通过调节蛋白质稳定性、亚细胞定位、翻译后修饰等在转录和转录后水平进行控制(图4，参考相关文献[6]绘制)。

→，表示激活调节；-|，表示抑制调节→，Indicate activating regulation；-|，Indicate inhibitory regulation图4 Nrf2活性调节机制Fig.4 Mechanisms of regulation of Nrf2 activity

3.1 Nrf2的转录及转录后调控

Nfe2l2基因启动子的近端区域包含ARE样元件，使Nrf2能够直接激活自身的转录，正反馈调节其自身的表达。在多环芳烃的暴露下，Nrf2由芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor,AhR)诱导产生。AhR与AhR核转运体形成异二聚体并结合到Nfe2l2基因启动子区的外源反应元件序列，从而反式激活Nfe2l2基因的转录，表明外源配体能够通过诱导AhR激活Nrf2通路[47]。Nfe2l2基因启动子区还包含核转录因子-κB(nuclear factor κB,NF-κB)结合位点，在发生炎症的牛乳腺上皮细胞中，NF-κB亚基p65表达上调，诱导Nrf2易位[48]。此外，致癌基因Kras、B-Raf和Myc[49]以及Notch信号通路[50]均能增强Nfe2l2的转录。

Nfe2l2 mRNA的转录后修饰在Nrf2激活和功能校正中发挥重要作用。 转录后修饰包括microRNA(miRNA)、长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)和Nfe2l2转录本的选择性剪接。miRNAs通过直接靶向Nrf2或Keap1 mRNA的3′-UTR序列，下调或上调Nrf2蛋白的表达[51]。在牛颗粒细胞中，过表达miR-28、miR-153和miR-708会下调Nrf2表达，造成ROS累积、线粒体活性和细胞增殖能力受损[52]。 然而，在生理状态下，miRNA对Nrf2的调控还有待进一步验证。lncRNA也能调控Nrf2的激活，如HOTAIR可提高Nrf2启动子区的组蛋白H4乙酰化水平、MALAT1能负调控Keap1的表达、TUG1直接与Nrf2蛋白互作等[53]。Nrf2活性还可通过Nfe2l2转录本的选择性剪接进行调控。一些肿瘤细胞表达Nfe2l2的转录变体，这些变体缺失编码Keap1相互作用域的外显子，导致Nrf2通路过度活跃[54]。最近一项研究发现，Nfe2l2 mRNA核输出和稳定的调节由两种靶向新生转录本3′-UTR区的mRNA结合蛋白(HuR和AUF1)调控[55]。

3.2 Nrf2蛋白稳定性的调控

Keap1是调节Nrf2蛋白稳定性的主要因子，其敲低或缺失会造成Nrf2在核内累积，刺激细胞保护基因的转录[56]。 泛素结合蛋白p62(又称SQSTM1)基因启动子区含有ARE序列，通过与Nrf2竞争介导Keap1的自噬降解以增强Nrf2蛋白的稳定性[57]。Tang等[58]研究乳酸锌对猪肠上皮细胞增殖、抗氧化能力等的影响时发现，乳酸锌处理可增加Nrf2蛋白的表达丰度，降低Keap1和p62蛋白表达，表明乳酸锌通过激活Nrf2-p62通路提高猪肠上皮细胞的抗氧化能力，可作为一种新型仔猪饲料添加剂。蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p21Cip1/WAF1、蛋白去糖酶DJ-1、肿瘤抑制因子BRCA1和乙酰转移酶p300等均可通过破坏Nrf2-Keap1的相互作用来增强Nrf2蛋白的稳定性[56,59]。此外，Nrf2蛋白稳定性也可通过非依赖Keap1的方式调节，包括β-TrCP/Cul1依赖途径和Hrd1依赖途径。对糖尿病肾病大鼠模型的研究发现，GSK-3β/β-TrCP轴的活化可加速Nrf2的降解，导致肾细胞存活受损[60]。Hrd1是一种E3泛素连接酶，条件性敲除小鼠肝脏中的Hrd1可显著增强Nrf2及其靶基因的表达[61]。 最新研究发现，Nrf2上的QSLVPDI基序是其与Hrd1相互作用的活性位点，X-box结合蛋白1下调通过抑制Hrd1介导的Nrf2泛素化保护肾缺血再灌注损伤[62]。

3.3 Nrf2亚细胞定位的调控

Nrf2核易位是Nrf2基因诱导细胞保护功能的关键环节之一。热应激会造成动物的胃肠损伤，Xu等[63]采用石榴苷处理大鼠肠上皮细胞，发现石榴苷处理能诱导HO-1表达，并以时间和剂量依赖性方式增加Nrf2核易位，其上游信号通路PI3K/Akt在石榴苷诱导的Nrf2核易位中起重要的调控作用。 脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)是一种常见的霉菌毒素，不仅会影响动物的采食量和生长性能，还会对妊娠母畜和胎儿造成毒性损伤。研究发现，氧化应激是DON诱导胚胎毒性的重要因素，DON处理后，Nrf2/HO-1通路被激活，Nrf2从细胞核易位到细胞质，说明Nrf2核易位可能对其起重要作用[64]。镉是一种重金属有毒元素，其引起的生态环境污染对人类和畜禽健康造成严重危害。Dong等[65]的研究发现，在镉暴露的原代肾小管细胞中自噬流被阻断，p62蛋白在胞内累积，Nrf2核易位增强，抑制AMPK磷酸化，使AKT/mTOR信号失活，最终导致肾小管细胞的氧化损伤。DJ-1是一种泛素化和多功能蛋白，可作为Nrf2的转录辅助激活因子。正常条件下，敲低DJ-1后Nrf2的核易位下降，表明DJ-1通过辅助Nrf2的核定位，正调控其介导的细胞抗氧化防御[66]。染色体维持蛋白1(chromosomal region maintenance 1，CRM1)是典型的核输出蛋白受体，可调控Nrf2的核输出。在内源性或外源性一氧化氮的暴露下，CRM1发生S-亚硝基化，CRM1的失活促进了Nrf2在核内的累积及其调控基因的转录激活[67]。此外，一些生物活性物质，如褪黑素[68]、生育三烯酚[69]、黄岑素[70]等均能激活Nrf2的核易位，启动抗氧化保护相关机制。

3.4 Nrf2信号的翻译后修饰调控

Nrf2可发生广泛的蛋白质翻译后修饰(post-translational modifications，PTMs)，如磷酸化、乙酰化、泛素化和SUMO化修饰等。在氧化应激条件下，Akt激活的GSK-3β使酪氨酸激酶Fyn的苏氨酸残基发生磷酸化，导致Nrf2在核内积聚；反之，Fyn催化Nrf2上Tyr568磷酸化，促进Nrf2由核内向胞质转出，抑制下游HO-1和NQO1基因的转录[71-72]。在脂毒性条件下，SQSTM1诱导Unc-51样自噬激活激酶1磷酸化，细胞发生巨自噬，导致Keap1降解和Nrf2激活[73]。

组蛋白修饰对Nrf2/Keap1通路也有影响。在组蛋白乙酰转移酶(histone acetyltransferase，HAT)p300/CREB结合蛋白(CREB binding protein，CBP)的作用下，Nrf2在Neh1区的DNA结合结构域发生乙酰化，启动依赖Nrf2的基因转录[74]。HAT p300与Nrf2相互作用，干扰Nrf2/Keap1复合物的形成，增加Nrf2蛋白丰度和稳定性，进而促进Nrf2的核定位[59]。同时，p300/CBP还参与NF-κB亚基p65介导的Nrf2活性的调节，招募组蛋白去乙酰酶3抑制ARE依赖的基因转录[75]。组蛋白赖氨酸N-甲基转移酶SetD7介导的H3K4me有利于转录因子Sp1与Keap1启动子结合，进而上调Keap1的转录并抑制Nrf2表达[76]。

SUMO化修饰是一种涉及小泛素样蛋白修饰分子(small ubiquitin-like modifier，SUMO)与含有SUMO结合基序的靶蛋白共价连接的修饰方式，通过影响蛋白质稳定性、蛋白质之间的互作等调节多种细胞过程[77]。Nrf2在SUMO1和SUMO2/3作用下发生SUMO化修饰，之后被部分转运到核体中，在多聚SUMO特异E3泛素连接酶RNF4作用下降解[78]。而另一种多聚SUMO特异E3泛素连接酶RNF11可增加Nrf2蛋白稳定性[79]。最新研究表明，SUMO2介导的Nrf2中K110和K533发生SUMO化修饰，通过增强Nrf2稳定性和核易位部分调节其转录活性[80]。

4 结 语

Nrf2处于一个复杂调控网络的中心，是调控细胞应对氧化应激的重要转录因子。当机体受到紫外线、辐射或炎性因子等外界应激因素刺激时，Nrf2介导的细胞保护基因上调表达变得尤为关键。 Nrf2的活性除了受其负性调节蛋白Keap1的精确调控外，还由细胞类型、活化刺激、ARE识别、辅激活因子/竞争性抑制剂、靶基因启动子区的表观遗传修饰等因素决定。 畜禽的繁殖障碍、抗病力弱、畜产品品质下降等均与氧化应激导致的氧化损伤有关。目前，关于Nrf2/Keap1-ARE信号通路的研究多集中在各种慢性疾病和癌症治疗以及Nrf2相关药物的临床筛选上，而Nrf2对畜禽抗氧化应激的调控仍处于不断探索中。 因此，深入了解Nrf2/Keap1-ARE信号通路的生物学功能及其调控机制，将有助于为畜禽健康及疾病治疗提供新的生物标志物和治疗策略。