瑶山亚种树鼩ISG15蛋白表达及其多克隆抗体制备

2022-02-15曹颖颖李慧君李宝莹唐海波

中国畜牧兽医 2022年1期

曹颖颖，李慧君，李宝莹，梁亮，冷静，唐海波

(1.广西中医药大学，南宁 530200；2.广西高发传染病中西医结合转化医学重点实验室，南宁 530200)

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染是严重的世界性公共卫生问题，也是导致肝脏纤维化和肝癌的重要因素。在抗乙肝病毒治疗中，目前可用的抗病毒药物有两类：核苷(酸)类似物(NAs)和干扰素α。干扰素是一种非特异的广谱抗病毒剂，主要通过诱导一系列干扰素诱导基因发挥抗病毒作用，虽然具有一定的抗病毒效果，但干扰素治疗仍然存在着药物副作用大、治疗周期长和病毒耐药等亟待解决的问题[1]。因此，深入研究乙肝病毒耐受干扰素导致慢性持续感染的分子机制、寻找潜在的新型乙型肝炎治疗药物靶点具有重要的科学意义和临床价值。干扰素作为固有免疫系统的重要成员，有抗病毒、抗肿瘤、抑制细胞增殖及免疫调节等多重作用[2-5]。当机体识别病毒感染并快速启动干扰素合成后，通过相关信号通路激活转录因子，促进干扰素刺激基因(interferon-stimulated genes，ISGs)的转录，最终引起数百种ISGs高表达。ISGs能参与多种生物学过程，如宿主防御、细胞凋亡、抗病毒及免疫调节等[6-8]，虽然很多ISGs的功能还有待挖掘，但它们在宿主抗病毒防御中的作用不容忽视。干扰素刺激基因15(interferon-stimulated gene 15,ISG15)编码一种15 ku的小分子蛋白质，在已发现的所有类泛素修饰蛋白中，ISG15是第一个被鉴定出的蛋白[9]。

近年来，ISG15在HBV中的作用引起了人们的广泛关注。Kim等[10]研究发现，ISG15酶修饰系统可以调节HBV的复制过程，进而影响慢性乙型肝炎患者向肝癌的发展。Qiu等[11]研究发现，ISG15可作为HBV相关性肝细胞癌新的预后生物标志物。而HBV感染具有严格的种属特异性和组织亲嗜性,可用于研究的动物模型很少。目前能感染人类HBV的常用实验动物是灵长类的黑猩猩、长臂猿等，由于其价格昂贵，一般只能用体外试验进行研究，没有经济适用的HBV感染动物模型，严重限制了HBV的研究进程。

树鼩是一种最接近灵长类的动物，个体小，繁殖能力强，在生理、解剖、神经发育、肝炎病毒感染特性及心理应激模式等方面与灵长类甚至人类高度相似[12-13]，是目前所知的除黑猩猩、长臂猿外能感染HBV的唯一动物。本研究拟从瑶山亚种树鼩的外周血淋巴细胞中克隆获得ISG15基因，构建其真核、原核表达载体并表达，通过原核表达纯化树鼩ISG15蛋白，经免疫小鼠后获得其多克隆抗体并鉴定其免疫原性，以期探索瑶山亚种树鼩ISG15基因对HBV复制的影响，为进一步研究树鼩的ISG15及病毒感染模型相关检测工具提供材料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源及试验动物瑶山亚种树鼩来自广西中医药大学人工驯化养殖实验中心；SPF级昆明小鼠(20 g±2 g)20只，雌雄各半，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司[SCXK(湘)2019-0004]。动物均在广西高发传染病中西医结合转化医学重点实验室按标准方法进行饲养[SYXK(桂)2019-0001]。试验经广西中医药大学伦理审查委员会审查通过(DW20201206-123)，动物使用遵循3R原则。树鼩麻醉后静脉取血用于外周血淋巴细胞分离。

1.1.2 主要试剂原核载体pET-28a(+)、BHK-21细胞株、pcDNA3.1(+)和大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞均由广西高发传染病中西医结合转化医学重点实验室保存；大肠杆菌DH5α感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；淋巴细胞分离液购自Stemcell Technologies公司；Lipofectamine 2000、限制内切酶BamHⅠ和XhoⅠ均购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；pMD18-T、TRIzol和逆转录试剂盒均购自TaKaRa公司；PCR Mix酶、质粒提取试剂盒和DNA胶回收试剂盒均购自天根生化科技(北京)有限公司；镍柱购自GE公司；弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂均购自碧云天生物技术公司；马抗鼠碱性磷酸酶抗体购自北京中衫金桥生物有限公司；其余试剂均为国产分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1 引物设计及合成根据GenBank数据库中滇西树鼩ISG15基因预测序列(登录号：JN866608)设计引物，上游引物ISG15-1：5′-AGACCTCAGAAGCAGCGAACT-3′；下游引物ISG15-2：5′-CCAAACCCTTCCTTACCCTC-3′，预计扩增片段长度为548 bp。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.2 RT-PCR扩增及克隆用TRIzol法提取树鼩外周血淋巴细胞总RNA，以Oligo(dT)18为下游引物进行反转录得到cDNA,以cDNA为模板PCR扩增ISG15基因片段。PCR反应体系50 μL：2×TaqPCR预混剂25 μL，上、下游引物各2 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 19 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环；72 ℃延伸5 min。PCR产物经2.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

使用DNA胶回收试剂盒对鉴定正确的PCR产物进行回收纯化，回收片段与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，取少量转化菌株涂布于LA平板于37 ℃过夜培养。挑取LA平板中生长的单菌落，于 37 ℃、220 r/min振荡培养3 h，菌液PCR鉴定阳性克隆质粒，目的条带利用DNA胶回收试剂盒回收后，送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.2.3 序列比对与氨基酸分析将测序获得的ISG15基因序列，与GenBank中滇西亚种树鼩、人、黑猩猩、倭黑猩猩、猕猴、金丝猴、猪、牛、羊、猫、大鼠和小鼠的ISG15基因mRNA序列进行相似性比对及遗传进化分析，利用DNAStar软件中的Protean对ISG15蛋白进行氨基酸的亲/疏水性和抗原性分析。

1.2.4 真核和原核表达质粒的构建根据克隆测序所得的树鼩ISG15基因序列设计真核表达引物，pcDNA3.1-ISG15U：5′-CGGATCCGCCACCA-TGGGCCGGGACTTGAAGG-3′(BamH Ⅰ)；pcDNA3.1-ISG15L：5′-CCTCGAGTTACCCTCCCCGCAGGC-GCA-3′(XhoⅠ)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以1.2.2获得的阳性克隆质粒为模板进行PCR扩增，PCR扩增体系与程序同1.2.2。用DNA胶回收试剂盒对目的条带进行回收纯化，用限制性内切酶BamH Ⅰ和XhoⅠ于37 ℃双酶切3 h，胶回收目的条带和pcDNA3.1(+)质粒，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，用胶回收试剂盒回收酶切好的目的片段和载体，二者用T4 DNA连接酶于16 ℃连接3 h，构建pcDNA3.1-ISG15真核表达载体。连接产物经酶切及测序鉴定正确后，将得到的重组质粒利用脂质体转染法转入BHK-21细胞，进行真核表达。

基于1.2.3中对ISG15基因氨基酸序列的亲/疏水性和抗原性初步分析后，设计原核表达引物，pET-ISG15U：5′-CGGATCCATGGGCCGGGACT-TGAAGGT-3′(BamH Ⅰ)、pET-ISG15L：5′-CCTCGAGCCCTCCCCGCAGGCGCAAAT-3′(XhoⅠ)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以1.2.2获得的阳性克隆质粒为模板进行PCR扩增，并用DNA胶回收试剂盒对PCR产物进行回收纯化，用限制性内切酶BamH Ⅰ和XhoⅠ于37 ℃双酶切3 h，胶回收目的条带和pET-28a(+)质粒，酶切后的产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，用胶回收试剂盒回收酶切好的目的片段和载体，二者用T4 DNA连接酶于16 ℃连接3 h，构建pET-28a-ISG15原核表达载体。连接产物经酶切及测序鉴定序列正确后，将得到的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞[14]，进行原核表达。

1.2.5 重组蛋白的诱导表达挑取转化pET-28a-ISG15的表达菌株单菌落，接种于5 mL LB液体培养基中(含100 μg/mL Kan+)，37 ℃、150 r/min过夜培养；按1∶100的比例接种于50 mL LB 培养基中(含100 μg/mL Kan+)，37 ℃、220 r/min培养约4 h使菌液D600 nm值为0.5～0.8，取1 mL菌液留样作为诱导前对照；剩余菌液加入IPTG至终浓度为0.5 mmol/L，30 ℃、220 r/min诱导表达6 h，取1 mL菌液留样作为诱导后菌液，与之前取出的诱导前菌液用SDS-PAGE分析蛋白的表达情况[15]。

1.2.6 重组蛋白ISG15的纯化及鉴定

1.2.6.1 重组蛋白表达形式检测重组蛋白经鉴定正确后进行大量诱导表达获取目的蛋白。按诱导表达步骤诱导表达1 000 mL菌液，8 000 r/min离心10 min，弃上清后收集菌体，按每克湿菌加10 mL裂菌缓冲液重悬菌体，于液氮中反复冻融3～4次后，置于低温环境超声裂解30 min破碎细菌细胞。裂解产物以4 ℃、12 000 r/min离心15 min，取适量裂解产物的上清和沉淀进行SDS-PAGE分析蛋白表达形式[16]。

1.2.6.2 包涵体的纯化重组蛋白融合了pET-28a(+)载体上带有的多聚组氨酸(6×His)标签，利用Ni2+金属鳌合亲和层析法进行纯化。蛋白用包涵体溶解液(50 mmol/L Tris-HCl、10 mmol/L EDTA和8 mol/L尿素)溶解后，暴露出6×His标签，再与3 mL Ni-NTA树脂充分混匀并室温结合30 min，按说明书操作收集洗脱蛋白，进行SDS-PAGE电泳分析纯化情况，并将包涵体利用梯度递降尿素浓度透析的方法进行复性，复性好的蛋白用超微量分光光度计检测浓度后，-80 ℃保存备用。

1.2.6.3 重组蛋白的鉴定利用Western blotting检测重组蛋白。纯化复性后的ISG15重组蛋白进行SDS-PAGE电泳，将蛋白转移至PVDF膜，以鼠抗His标签抗体为一抗、碱性磷酸酶标记马抗小鼠IgG抗体为二抗，BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒显色观察。

1.2.7 抗体制备及反应性检测将弗氏佐剂与纯化复性后的ISG15蛋白(100 μg/只)乳化后免疫昆明小鼠，免疫周期为第1、7、28、35和45天，免疫方式为背部皮下多点注射。首次免疫用弗氏完全佐剂与ISG15乳化，第2、3、4、5次免疫用弗氏不完全佐剂与ISG15乳化。第5次免疫后1周小鼠摘眼球取血并处死，分离血清，Western blotting和间接免疫荧光技术(IFA)检测多克隆抗体的反应性。Western blotting试验：以不同稀释度的抗ISG15多克隆抗体为一抗，未免疫小鼠血清为阴性对照，碱性磷酸酶标记马抗小鼠IgG抗体为二抗，BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色观察。IFA试验：用转染pcDNA3.1-ISG15真核表达载体24 h后的单层BHK-21细胞，按1∶100分别稀释制备的抗ISG15多克隆抗体和未免疫小鼠阴性血清作为一抗，以1∶300稀释FITC标记的马抗小鼠IgG作为二抗，在荧光显微镜下观察。

2 结果

2.1 ISG15基因PCR扩增与相似性分析

提取瑶山亚种树鼩外周血淋巴细胞总RNA，RT-PCR扩增得到548 bp的ISG15基因片段(图1A)，与预期片段大小相符。将ISG15基因克隆后进行菌液PCR检测，电泳结果显示有目的条带，证明ISG15基因已成功克隆到pMD18-T载体上(图1B)。对阳性克隆质粒测序分析发现，与GenBank中滇西亚种树鼩ISG15基因mRNA序列相似性为99.6%，与人、猩猩及猴的相似性较高，为78.1%～78.7%(图2)。系统进化树分析发现，瑶山亚种树鼩与人、猩猩及猴的亲缘关系较近(图3)，这一结果与相似性分析结果一致。

M，DL2000 DNA Marker；1、2，树鼩ISG15基因PCR扩增；3、6，阴性对照；4、5，树鼩ISG15基因克隆菌液PCR扩增M，DL2000 DNA Marker;1 and 2，PCR amplification of ISG15 gene in T.b.yaoshanensis;3 and 6，Negative control；4 and 5，PCR amplification of clony bacterial fluid of ISG15 gene in T.b.yaoshanensis图1 树鼩ISG15基因PCR扩增(A)和克隆鉴定(B)Fig.1 PCR amplification (A) and colony identification (B) of ISG15 gene in T.b.yaoshanensis

图2 瑶山亚种树鼩ISG15基因相似性比对Fig.2 Similarity alignment of ISG15 gene in T.b.yaoshanensis

图3 瑶山亚种树鼩ISG15基因系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree of ISG15 gene in T.b.yaoshanensis

2.2 ISG15氨基酸序列分析

利用DNAStar软件分析瑶山亚种树鼩ISG15蛋白的结构，包括N-端和C-端，结果显示，该蛋白富含亲水性氨基酸，疏水性氨基酸整体较少，只出现在中间的个别肽段位置(图4)。

图4 瑶山亚种树鼩ISG15蛋白结构分析Fig.4 Structure analysis of ISG15 protein in T.b.yaoshanensis

2.3 ISG15基因真核及原核表达载体的构建

分别构建瑶山亚种树鼩ISG15基因的真核及原核表达载体。真核表达载体pcDNA3.1-ISG15和原核表达载体pET-28a-ISG15经菌液PCR和酶切鉴定，菌液PCR图中在500 bp左右出现目的条带(图5A、6A)，酶切鉴定图中在约500和5 000 bp处出现目的条带和载体条带(图5B、6B)，初步鉴定结果显示质粒为阳性。经测序分析，pcDNA3.1-ISG15真核表达载体和pET-28a-ISG15原核表达载体读码正确，未发生错位，表明真核及原核表达载体构建成功。

M1，DL2000 DNA Marker；1、2，菌液中ISG15基因的PCR产物；M2，DL10000 DNA Marker；3、4,重组质粒pcDNA3.1-ISG15的BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切结果M1，DL2000 DNA Marker；1 and 2，PCR products of ISG15 gene in bacterial liquid；M2，DL10000 DNA Marker；3 and 4，Recombinant plasmid pcDNA3.1-ISG15 by the restriction digestion with BamH Ⅰ and Xho Ⅰ图5 重组质粒pcDNA3.1-ISG15菌液PCR(A)及双酶切(B)鉴定Fig.5 Identification of the recombinant plasmid pcDNA3.1-ISG15 by bacterial liquid PCR (A) and double enzymes digestion (B)

2.4 ISG15重组蛋白的诱导表达、纯化鉴定及多克隆抗体制备

将重组质粒pET-28a-ISG15转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞并诱导表达，最终以30 ℃、0.5 mmol/L IPTG诱导6 h获得高表达(图7A)，主要在超声波破碎细菌后的沉淀中检测到重组ISG15蛋白(22 ku)(图7B)，说明蛋白主要以包涵体的形式表达。重组蛋白经过Ni2+亲和层析纯化后得到杂蛋白较少、浓度较高的ISG15蛋白(图7C)。经过纯化后复性并浓缩的重组蛋白浓度为4.1 mg/mL。

M1，DL2000 DNA Marker；1，菌液中ISG15基因的PCR产物；M2，DL10000 DNA Marker；2，重组质粒pET-28a-ISG15的BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切结果M，DL2000 DNA Marker；1，PCR products of ISG15 gene in bacterial liquid；M2，DL10000 DNA Marker；2，Recombinant plasmid pET-28a-ISG15 by the restriction digestion with BamH Ⅰ and Xho Ⅰ图6 重组质粒pET-28a-ISG15菌液PCR(A)及双酶切(B)鉴定Fig.6 Identification of the recombinant plasmid pET-28a-ISG15 by bacterial liquid PCR (A) and double enzymes digestion (B)

M，蛋白质分子质量标准；1、5，0.5 mmol/L IPTG诱导6 h重组菌ISG15蛋白；2、4、未诱导重组菌；3,0.5 mmol/L IPTG诱导6 h的pET-28a(+)；6，0.5 mmol/L IPTG诱导6 h后重组菌裂解菌体的上清；7，0.5 mmol/L IPTG诱导6 h后重组菌裂解菌体的沉淀；8，穿透液；9，洗涤液1；10，洗涤液2；11，洗脱液1；12，洗脱液2M,Protein Marker；1 and 5,ISG15 protein induced with 0.5 mmol/L IPTG for 6 h；2 and 4,Uninduced recombinant bacteria；3,The pET-28a(+) induced with 0.5 mmol/L IPTG for 6 h；6，The supernatant of the recombinant bacteria induced with 0.5 mmol/L IPTG for 6 h；7，The sediment of the recombinant bacteria induced with 0.5 mmol/L IPTG for 6 h；8，Penetration fluid；9，Detergent 1；10，Detergent 2；11，Elution 1；12，Elution 2图7 ISG15蛋白原核表达(A)、表达形式(B)及纯化(C)鉴定Fig.7 Identification of prokaryotic expression (A)，expression form (B) and purification (C) of ISG15 protein

Western blotting鉴定结果表明，纯化的重组蛋白带有His标签(图8)，与预测的蛋白加标签蛋白大小基本一致，表明ISG15蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中正确表达。以复性后的ISG15重组蛋白制备抗原免疫昆明小鼠，免疫程序结束后1周采血分离血清，所得血清即为鼠源树鼩ISG15多克隆抗体。利用Western blotting方法检测抗体的反应性，结果显示,制备的多克隆抗体在稀释度为1∶8 000时仍能够与0.01 μg的ISG15重组蛋白结合，与抗His标签单克隆抗体相比，制备的ISG15多克隆抗体反应性良好。

①A，His抗体稀释度1∶2 000；B，His抗体稀释度1∶4 000。②M,蛋白质分子质量标准；1～4，抗原上样量分别为1、0.1、0.01和0.001 μg①A，The His antibody dilution was 1∶2 000；B，The His antibody dilution was 1∶4 000.②M,Protein Marker;1-4,The loading amount of antigen was 1,0.1,0.01 and 0.001 μg,respectively图8 His标签鉴定ISG15蛋白Fig.8 Identification of ISG15 protein by His tag

2.5 间接免疫荧光技术验证抗体的反应性

由图9可知，在转染了pcDNA3.1-ISG15的BHK-21细胞上孵育制备的ISG15多克隆抗体均出现了特异性绿色荧光，分布于细胞核及细胞浆中，有成小团状聚集或均质分布，而用阴性血清孵育的相同转染的BHK-21细胞则无特异性荧光。

A，pcDNA3.1-ISG15真核表达载体转染BHK-21细胞后用抗ISG15多克隆抗体孵育；B，pcDNA3.1-ISG15真核表达载体转染BHK-21细胞后用阴性血清孵育A，The BHK-21 cells transfected with pcDNA3.1-ISG15 eukaryotic expression vector were incubated with anti-ISG15 polyclonal antibody;B，The BHK-21 cells transfected with pcDNA3.1-ISG15 eukaryotic expression vector were incubated with negative serum图9 间接免疫荧光检测多克隆抗体的反应性(400×)Fig.9 Reactivity of polyclonal antibody by indirect immunofluorescence analysis (400×)

3 讨论

树鼩是一种外形与松鼠类似的遗传上最接近灵长类的动物，其作为新兴实验动物，在病毒感染模型方面相较于啮齿类实验动物有着不可替代的作用。研究认为，树鼩是灵长类动物的近亲，在生理机能、生化代谢和基因组等方面与人相似，而远高于小鼠、大鼠等常用啮齿类实验动物[13]；树鼩能被多种与人类疾病有关的病毒感染[17-19]；与灵长类实验动物相比，树鼩具有体型小、繁殖快、成本低等特点，因此，树鼩在医学研究中的价值受到越来越多的关注。目前，学者对树鼩的解剖学、生殖生理学、脑部中枢神经系统、视觉系统、动物模型等方面已进行了大量的研究[20-25]，且有了较为全面和深入的了解。在病毒学方面，树鼩成为研究如肝炎病毒和轮状病毒等感染和致病机制的理想动物模型，但还存在一些问题，尤其是树鼩免疫系统和免疫应答相关细胞因子等研究相对匮乏，也缺乏树鼩特异性抗体等生物制剂，使流式细胞术和免疫组织化学技术等难以开展，严重限制了病毒感染动物模型在相关研究上的应用。

3.1 树鼩ISG15基因的克隆与表达系统的构建

本研究通过RT-PCR扩增获得了瑶山亚种树鼩ISG15基因，长548 bp，与GenBank中登录的人、黑猩猩、倭黑猩猩、猕猴、金丝猴、家猪、牛、羊、猫、大鼠和小鼠等ISG15基因mRNA序列进行相似性比对，结果显示，树鼩ISG15基因与人、猩猩及猴等相似性较高，为78.1%～78.7%，高于大鼠、小鼠与人、猩猩及猴的相似性(70.8%～73.9%)。构建系统进化树发现，瑶山亚种树鼩ISG15基因与人和猴亲缘关系更加接近，和人、猴等共同组成的大分支与大鼠、小鼠等组成的大分支以及牛、羊等组成的大分支三者处于平行位置，所以树鼩ISG15基因在遗传水平上与人和猕猴等关系更加密切，进一步验证了其进化上的优势。

由于真核表达可反映ISG15蛋白在哺乳动物细胞中的自然折叠及构象等，能观察到其空间分布及定位，本研究构建了pcDNA3.1-ISG15真核表达载体，并转染BHK-21细胞进行蛋白过表达，构建的真核表达载体得到了很好的表达，为后期进行树鼩ISG15蛋白的功能性研究奠定基础。

原核表达重组蛋白具有操作相对简单、蛋白表达量高、易于大规模生产等优点，因此本研究采用pET系统载体诱导表达瑶山亚种树鼩ISG15蛋白。将克隆测序得到的ISG15基因翻译成氨基酸序列后利用DNAStar分析氨基酸的亲/疏水性与抗原性，结果表明，ISG15整体片段的亲水性与抗原性良好，没有连续长片段的疏水氨基酸，因此尝试构建包含整个ISG15基因ORF的原核表达载体。结果显示，构建的原核表达载体一次性表达成功，诱导原核表达的试验中改变了各种诱导表达的条件，虽然有少量蛋白以可溶性的形式表达，但其产量远远低于包涵体形式的表达量。

3.2 ISG15蛋白纯化与多克隆抗体制备

在蛋白纯化方面，重组蛋白融合了pET-28a(+)载体上带有的6×His标签，蛋白使用含有高浓度尿素的包涵体溶解液溶解后，二级结构暴露较好，过镍柱时重组蛋白His组氨酸标签与镍离子较充分地鳌合，蛋白挂柱成功。利用递降pH的洗脱缓冲液洗脱回收目的蛋白，洗脱液中杂蛋白较少，重组蛋白浓度较高，获得了较优良的ISG15蛋白。由于使用高浓度尿素的包涵体溶解液溶解包涵体，因此纯化得到的蛋白是变性蛋白而没有活性，需要对其进行复性和重新折叠。本研究采用逐步透析法不断降低变性剂中尿素浓度来复性蛋白的策略，在透析液中加入甘油、精氨酸来抑制聚集和促进蛋白天然构象形成，加入氧化/还原型谷胱甘肽促进蛋白构象还原键的形成，结果证实，纯化蛋白经过透析复性之后免疫原性及活性完好。提示富含亲水性氨基酸肽段，不一定以可溶性的形式表达，也可能是以包涵体的形式表达，与理论预测不一致，但总体上富含亲水性氨基酸的蛋白更容易表达与纯化，与Ni2+金属鳌合后再洗涤与洗脱，可得到较纯的目的蛋白。同时如果得到的蛋白浓度较低，可以在蛋白复性透析后用PEG20000在4 ℃条件下进行浓缩，提高蛋白的浓度。ISG15重组蛋白经乳化后免疫小鼠，成功获得了小鼠抗树鼩ISG15多克隆抗体，Western blotting和IFA试验显示了该抗体具有良好的反应性，为研究树鼩抗病毒作用机制等奠定了基础。