不同针刺方式对早期膝骨关节炎兔模型软骨细胞及Ⅱ型胶原蛋白代谢的影响

史晓伟，王东峰，邓晓丰，于文静，赵 颖，史术峰

(北京中医药大学第三附属医院，北京 100029)

膝骨关节炎(Knee Osteoarthritis，KOA)是一种严重影响老年人的慢性骨关节退行性疾病，最常见的临床表现为膝关节疼痛及功能活动障碍等，但根本的病因是膝关节软骨退变破坏并进行性加重[1]。导致KOA发病的高危因素众多，包括性别、年龄、肥胖和关节过度使用等，这其中膝关节承受的异常生物力在发挥着重要作用[2]，Felson DT教授认为骨关节炎可以定义为一种生物力学疾病[3]，重点突出了生物力学异常相关因素在KOA发病的关键作用。在膝关节的稳定中，膝周肌肉组织发挥动力性作用，肌肉结构功能异常会导致关节软骨生物力学环境改变从而导致KOA发生，研究证实膝周肌肉无力加速KOA的发病与进展[4]。因此，通过干预肌肉软组织进而间接纠正关节软骨生物力学环境，从而延缓KOA软骨病变是一种良好的治疗策略。笔者前期研究发现针刀、电针具有改善早期KOA兔股直肌、股二头肌萎缩的作用，那么其对膝关节软骨是否发挥保护作用？针刀、电针对改善早期KOA兔模型关节软骨损伤哪个治疗效果更佳？基于以上疑问，本研究探索针刀、电针对早期KOA兔模型膝关节软骨细胞结构及Ⅱ型胶原的表达情况，为针刀、电针治疗KOA提供动物实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

30只健康清洁级新西兰雄兔(6月龄，体质量2.5～3.0 kg)，购买并饲养于北京金牧阳实验动物有限公司(动物生产许可证号：SCXK 2015-0005；动物使用许可证号：SYXK 2015-0008)，所有实验动物单笼饲养[温度(22±2)℃，相对湿度(45±5)%]，并自由获取食物和水。本实验研究获得北京中医药大学动物伦理委员会批准，实验过程严格按照实验动物管理规定进行。

1.2 主要试剂及仪器

树脂绷带(100 mm ×1 800 mm，泰洲牌，揭西县泰洲医疗有限公司)；高分子固定绷带(KCP04，可耐特牌,苏州可耐特医疗科技有限公司)；一次性针刀(0.35 mm×25 mm，喜灸牌,德邦医疗有限公司)；一次性使用针灸针(0.2 mm×13 mm，环球牌,苏州针灸医疗用品有限公司)；电针治疗仪(SDZ-Ⅱ，华佗牌,苏州医疗用品有限公司)；塞来昔布(批号：国药准字J20120063；西乐葆，0.2 g/片，辉瑞制药有限公司)；兔CTX-2ELISA试剂盒(60456RA,北京瑞格博科技有限公司)；山羊抗兔Type Ⅱ一抗(1320-01,美国SouthernBiotech有限公司)；小鼠抗兔 F-actin一抗(ab205,美国Abcam公司)；CY3-驴抗山羊二抗(A0502,北京碧云天科技有限公司)；488-山羊抗小鼠二抗(A0428,北京碧云天科技有限公司)；全自动酶标仪(Varioskan Flash，美国Thermo公司)；激光共聚焦显微镜(FV3000,日本奥林巴斯有限公司)。

1.3 KOA兔模型制备

KOA兔模型制备的原理为下肢过伸位固定制动法(改良Videman法)，具体造模方法参照本团队前期研究[5-6]，简要步骤包括：①兔左后肢伸直，医用胶带贴紧兔毛完全缠绕左后肢；②泡沫双面胶(0.5 cm厚；上海得力文具有限公司)覆盖医用胶带(范围从腹股沟至膝盖)；③树脂绷带沿泡沫双面胶范围缠绕1圈；④高分子固定绷带缠绕树脂绷带1周；⑤树脂绷带再次缠绕1圈、同时医用胶带固定,最后形成一个类似“石膏”样的制动装置。连续制动4周。

1.4 动物实验分组及干预方法

新西兰兔(30只)根据体质量，随机数字表法分为空白组(6只)和造模组(24只)，空白组正常饲养，KOA造模组进行动物模型制备。KOA兔制动4周后，拆除固定装置，适应性饲养3 d，根据Lequesne MG评分[7]再随机分为模型组、针刀组、电针组和西药组(每组6只)。各组干预治疗方案：

1.4.1 空白组和模型组 正常抓取，同时进行纯水3 mL灌胃，1次/d。

1.4.2 针刀组 每日纯水3 mL灌胃，同时进行针刀干预(每周2次)，针刀进针点：股内、外侧肌腱止点、股直肌腱止点、股二头肌腱止点、鹅足腱囊以及局部压痛反应点、结节点；进针方法：针刀刀体与皮肤切面垂直、与肌纤维走行平行刺入，每次1～2刀，出刀后加压止血。

1.4.3 电针组 8个常用穴位分别为：血海、梁丘、内膝眼、犊鼻、阴陵泉、阳陵泉、委中及曲泉(取穴参照《实验针灸学》)，一次性无菌针灸针刺入(深度10 mm)，电极依次连接委中-梁丘组和血海-曲泉组(疏密波，频率2/100 Hz，强度2 mA)进行电刺激，每次20 min，隔天1次。

1.4.4 西药组 进行塞来昔布灌胃治疗(溶于纯水，剂量为10 mg/kg)，1次/d。各组均干预治疗4周。

1.5 兔血清、膝关节液CTX-2含量的检测

新西兰兔进行耳缘静脉取血，低温冷冻离心机4 ℃ 15 000 rpm离心20 min后，取上清液即为兔血清。应用空气栓塞法处死兔子，将兔膝关节腔切开一小口，用0.9%氯化钠溶液(2 mL)反复冲洗关节腔获得关节腔液。兔血清、关节液Ⅱ型胶原C端肽(CTX-2)含量应用ELISA试剂盒进行检测，操作严格按照说明书进行(60456RA，北京瑞格博)。首先根据标准品浓度计算标准曲线，计算各组样品CTX-2含量并统计学分析。

1.6 膝关节软骨免疫荧光双标染色

兔膝关节置于冰台上，迅速分离股骨、胫骨，剪骨刀快速切取软骨组织(股骨内侧髁)，4%多聚甲醛固定72 h，充分浸入15%乙二胺四乙酸(EDTA)脱钙4周。预处理完成的软骨组织常规脱水、透明、石蜡包埋并切片备用(4 μm厚度)。

免疫荧光双标染色简要步骤：①软骨玻片在烤片机上65 ℃烤片1 h;②常规进行脱蜡、水化;③切片浸入EDTA修复液(pH 6.0)进行抗原修复15 min(微波炉法);④3 %双氧水室温浸泡30 min;⑤PBS液冲洗玻片，滴牛血清白蛋白(A8020；北京索莱宝)室温孵育2 h;⑥滴加山羊抗兔Type Ⅱ一抗(1∶100)和小鼠抗兔F-actin一抗(1∶100)4 ℃冰箱过夜;⑦PBS液冲洗，滴加荧光二抗：CY3-驴抗山羊(1∶100)和488-山羊抗小鼠(1∶100)37 ℃避光孵育1 h;⑧DAPI染核10 min(避光);⑨防淬灭水溶性封片剂(S2100；北京索莱宝)封片，4 ℃冰箱保存。染色完成的荧光切片在激光共聚焦显微镜下进行观察并拍片，使用Image-Pro Plus软件分析数据。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 各组兔膝关节液、血清CTX-2含量比较

与空白组比较，模型组关节液CTX-2含量表达升高，但差异无统计学意义(P>0.05)；干预后，与模型组比较，针刀可降低关节液CTX-2表达，但无统计学意义(P>0.05)，电针明显降低关节液CTX-2表达(P<0.05)，西药显著降低关节液CTX-2表达，差异有统计学意义(P<0.01)。

与空白组比较，模型组血清CTX-2含量表达显著升高(P0.01)；干预后，与模型组比较，针刀、电针可降低血清CTX-2表达，但差异无统计学意义，西药可明显降低血清CTX-2表达(P<0.05)；针刀与电针治疗在调节血清CTX-2方面差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组兔血清、膝关节液CTX-2含量比较

2.2 各组兔膝关节软骨免疫荧光染色结果比较

典型兔股骨内侧髁软骨免疫荧光双标染色可知，细胞核染成蓝色(DAPI)，F-actin细胞骨架蛋白染成绿色，Ⅱ型胶原蛋白染成红色。各指标的统计分析以固定视野内累计光密度(IOD)指标进行量化。见图1。

在细胞核层面可知，与空白组比较，模型组细胞核IOD与空白组比较明显降低(P<0.05)；干预治疗后，与模型组比较，针刀组与电针组细胞核IOD表达升高，但差异无统计学意义，西药组细胞核IOD表达显著升高(P<0.01)。

在F-actin骨架蛋白层面，与空白组比较，模型组F-actin骨架蛋白IOD显著降低(P<0.01)；干预后，与模型组比较，针刀组和电针组F-actin骨架蛋白IOD表达升高差异无统计学意义，西药组骨架蛋白IOD表达明显升高(P<0.05)。

在Ⅱ型胶原蛋白层面，与空白组比较，模型组Ⅱ型胶原蛋白IOD显著降低(P<0.01)；干预后，与模型组比较，针刀组和电针组Ⅱ型胶原IOD表达量升高，但差异无统计学意义，西药组Ⅱ型胶原IOD表达量明显升高(P<0.05)；针刀组调节Ⅱ型胶原表达与电针组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组兔膝关节软骨细胞核、F-actin骨架蛋白和Ⅱ型胶原表达比较

3 讨论

膝骨关节炎(KOA)属于中医“痹证”范畴，其核心病理机制是关节软骨的退变及进行性加重，典型临床表现为膝关节疼痛及关节活动功能障碍[8]。随着研究的深入，国际上对KOA的认识不断更新，其中膝关节生物力学异常因素逐渐得到重视，有研究者重新定义KOA为炎症和生物力学因素共同作用导致的一种全关节疾病，病变的组织包括滑膜、软骨、关节周围的韧带肌肉及软骨下骨等[9]。这种KOA的新定义，除外广泛认可的炎症因素[10]，突出强调了膝关节异常生物力学的关键作用。美国D.T.Felson教授甚至认为骨关节炎就是一种生物力学疾病[3]。在认识到生物力学因素在KOA致病中的关键作用后，研究者试图通过改善膝关节周围生物力学环境来治疗KOA，常见的方法包括减重(减轻膝关节的机械负荷[11])、楔形鞋垫的应用(改善膝关节生物力线[12])、辅助支具(减轻膝关节压力负荷[13])以及康复锻炼(改善膝周肌肉功能[14])。既往研究证实KOA患者存在股四头肌萎缩的现象[15]，同时肌肉无力与KOA症状加重密切相关[4]；细胞实验证实了适度的压力负荷会促进软骨细胞及细胞外基质的合成代谢[16]。因此通过改善KOA膝周肌肉功能，间接改善关节软骨力学环境，从而延缓软骨破坏退变是一种可行的治疗策略。

我们团队前期研究证实了制动4周KOA兔股直肌、股二头肌存在肌肉萎缩现象，通过针刀、电针干预后可明显改善肌肉萎缩状态，那么针刀、电针对肌肉结构功能的改善能否对膝关节软骨发挥保护作用？本研究应用免疫荧光双标染色，对关节软骨组织的细胞核、细胞膜骨架蛋白和Ⅱ型胶原蛋白等结构在激光共聚焦显微镜下的区分显色。关节软骨组织大致分为两部分，软骨细胞及包绕软骨细胞发挥保护作用的细胞外基质(ECM)，软骨细胞合成分泌构成ECM结构的蛋白分子等，ECM结构为软骨细胞提供合适的空间结构。关节软骨发生磨损病变后，对软骨细胞和细胞外基质的表达均会产生影响。本研究结果发现，固定视野内模型组细胞核IOD与空白组比较显著减少(P<0.05)，同时模型组细胞膜骨架蛋白F-actin IOD与空白组比较也显著减少(P<0.05)，笔者定量观测的AOI是从软骨浅表层开始往下的目标区域，提示与空白组比较，模型组固定视野内软骨细胞显著减少；干预治疗后，针刀组和电针组细胞核和F-actin骨架蛋白IOD表达有一定程度升高，差异无统计学意义；而西药组细胞核和F-actin骨架蛋白IOD表达与模型组比较显著升高，提示针刀、电针对固定视野内软骨细胞有一定保护作用，但西药组效果更佳。软骨ECM主要由水、胶原和蛋白多糖等构成的复杂网状结构，其中Ⅱ型胶原蛋白在维持关节软骨结构和功能方面发挥关键作用[17]，既往研究已证实软骨细胞合成分泌的胶原中90 %以上为Ⅱ型胶原[18]，因此Ⅱ型胶原的含量可间接反映ECM功能状态。本研究结果发现，软骨切片在固定视野内Ⅱ型胶原蛋白IOD与空白组相比显著减少，与其他研究者结果一致[19]，提示关节软骨ECM存在破坏降解增多；干预治疗后，针刀、电针Ⅱ型胶原蛋白IOD与模型组比较表达有升高趋势(P>0.05)，但西药组Ⅱ型胶原蛋白IOD表达更高(P<0.05)，提示针刀、电针对早期KOA兔关节软骨Ⅱ型胶原具有一定保护作用，但效果不及西药。

CTX-2是Ⅱ型胶原蛋白剪切体的羧基末端肽,软骨分解代谢后可进入血液和关节液等体液组织中，既往研究证实CTX-2含量浓度与Ⅱ型胶原蛋白损伤程度呈正相关[20]。笔者应用ELISA法对兔血清及膝关节液CTX-2含量进一步进行探索，结果发现，模型组血清及关节液CTX-2含量与空白组比较表达升高，提示模型组关节软骨Ⅱ型胶原降解增多；干预治疗后，针刀、电针血清及关节液CTX-2含量表达降低(其中电针关节液P<0.05),而西药组血清及关节液CTX-2含量表达显著降低(P<0.05或P<0.01)，提示西药组缓解关节软骨Ⅱ型胶原降解作用最佳，针刀、电针具有一定程度的保护作用。本结果与免疫荧光Ⅱ型胶原的表达相一致。

从理论假说来讲，既然针刀、电针具有改善早期KOA肌肉萎缩的作用，那么肌肉结构的改善其作用于膝关节的生物力必然引起改变，关节的异常生物力学环境发生改变进而对软骨发挥保护作用，延缓关节软骨细胞死亡及细胞外基质的降解。但本研究结果仅证实了针刀、电针对关节软骨具有一定的保护缓解作用，而关节软骨保护最佳的是西药塞来昔布。既往研究已经证实针刀[21]、电针[22]对减轻KOA患者疼痛、改善关节功能活动的有效性，针刀、针刺干预KOA也被膝骨关节炎阶梯治疗专家共识(2018年版)[23]以及膝骨关节炎中医诊疗专家共识(2015年版)[24]所推荐。针刀干预的定点主要在肌肉肌腱的起止点及敏感压痛点，可能主要发挥止痛、松解粘连和调节本体感受器等[5]，而电针具有复杂的镇痛机制[25]，同时还有研究者发现电针具有一定的抗炎作用(调节NF-κB通路[26])，理论上讲电针可能比针刀缓解关节软骨降解更佳，结果发现针刀、电针在关节软骨保护方面差异无统计学意义。本研究证实的塞来昔布具有最佳的关节软骨保护作用，塞来昔布是选择性非甾体消炎药的代表，通过抑制COX、降低前列腺素(PG)合成，从而降低外周神经敏化或疼痛强度，达到镇痛作用[27]，是国内外众多膝骨关节炎指南推荐的一线用药。塞来昔布发挥软骨保护作用可能的机制是：①缓解疼痛，改善下肢运动，从而缓解肌肉萎缩状态；②研究证实塞来昔布可减少“炎症风暴”炎症因子的释放而发挥强大抗炎作用[28]，事实上炎症因素也是KOA发病中另一个非常重要的环节。本研究发现针刀、电针对膝关节软骨有一定的保护作用，增加样本量或者延长干预治疗时间对其缓解软骨降解的作用是否更显著？针刀、电针联合塞来昔布治疗KOA，其膝关节软骨保护作用是否更佳？这些假设需要进一步研究证实。

综上，针刀、电针对早期KOA兔模型膝关节软骨细胞及Ⅱ型胶原蛋白代谢具有一定保护作用，但效果不如塞来昔布。