基于DNA纳米结构的药物递送系统用于癌症治疗的研究进展

王丹凤吴玉姝翁甜欣王 璐刘 敏

(1.聊城大学生物制药研究院,山东 聊城 252059;2.聊城大学化学化工学院,山东 聊城 252059)

DNA 作为一种天然的生物大分子,其碱基配对原则及独特的双螺旋结构等特点使得我们能够对选定的DNA 序列进行编辑、修饰等操作。20世纪80年代,Seeman教授[1]首次提出基于GC/AT 碱基互补配对的原理,DNA 可以作为一种新的工具来构建纳米结构,并设计了十字叉状的双链DNA 结构(图1),从此开创了结构DNA 纳米技术这一新领域。这使得DNA 从传统的基因图谱被拓展成为建筑模块,用于构建特定形状及功能的纳米结构。目前用于构建DNA 纳米结构的两种主要方法为模块结构组装和DNA 折纸技术。相比于模块结构组装方法,后来出现的DNA 折纸技术降低了制作纳米结构的难度,并能够构建出复杂且形状多样的结构。以DNA 单链为模板自组装形成的DNA 纳米结构已经从简单的双链发展到四面体、折纸结构、立体笼状等三维立体以及更复杂的结构,从静态结构发展到动态结构,被广泛应用于药物运输、外科手术、医疗诊断等领域。

图1 Seeman教授构建的十字叉状DNA 纳米结构[1]

与双螺旋DNA 相比,由于固定的Holliday连接的存在,DNA 纳米结构具有更复杂的刚性结构。它的可控性以及基于碱基互补配对的自组装特点,使其成为一种具有潜力的载体材料,并且在载药方面表现出较其他纳米材料的优越性。研究人员将具有靶向性的适体杂交到DNA 纳米结构上或设计到DNA 链中以实现靶向功能。在作为药物递送载体应用于癌症治疗时,DNA 纳米结构因具有良好的靶向性、特定的尺寸大小、易于化学修饰和良好的生物相容性等优点,能够提高抗癌药物的溶解度、体内稳定性和肿瘤治疗效果[2]。目前化学药物、基因药物、光敏剂以及辅助免疫药物是研究较多的抗癌药物,但是传统的药物治疗存在许多缺陷,比如产生全身细胞毒性及药物疗效不理想等。使用DNA 纳米结构运载抗癌药物,可携带药物分子靶向至病变部位,提高对癌细胞的杀伤力[3],抵抗药物被血清中的酶降解,克服癌细胞的多药耐药性,降低药物的毒副作用[4]。小分子药物、小干扰RNA(siRNA)、免疫刺激寡核苷酸CpG、光敏剂和蛋白质等多种物质已成功地通过DNA 纳米载体递送到细胞内,并表现出良好的治疗效果[5]。此外,DNA 纳米结构作为载体用于药物递送时,不仅可以运载单药,还可运载双药及多种不同的药物分子,从而实现多种药物的联合治疗,发挥“1＋1＞2”的协同效果[6]。因此,DNA 纳米结构在肿瘤治疗方面发挥了重要作用,其靶向能力、载药能力及对药物的控制释放能力被广泛研究。

1 静态DNA纳米结构

静态DNA 纳米结构作为药物载体相对于其他纳米材料表现出显著的优越性,已被广泛用于递送小分子药物、寡核苷酸类药物和蛋白药物等。

1.1 DNA多面体

DNA 多面体在药物的加载和释放等方面显示出巨大的潜力。根据碱基互补配对原则,已经有大量的DNA 多面体被构建出,如DNA 四面体、DNA 八面体、DNA 二十面体等。

DNA 四面体作为最简单的三维DNA 纳米结构,由于它的空间位阻和纳米尺度上的刚性,对酶降解具有较强的稳定性,为药物的递送奠定了基础。DNA 四面体结构的稳定性以及对药物的高负载率使其在运载抗癌药物方面发挥了显著优势。随着化疗药物的多次使用,癌细胞会对一种或多种抗癌药物产生耐药性,这种多药耐药性已成为制约化疗效果的瓶颈[7]。而DNA 四面体能携带抗癌药物靶向到达病变部位,克服多药耐药性,提高疗效。由于蒽环类药物能够通过嵌插结合的方式插入DNA 中富含GC 的区域,基于这一特性,可利用DNA 纳米结构作为药物递送载体来克服药物本身缺陷。Kim 等人[8]将抗癌药物阿霉素(DOX)与DNA 四面体混合得到复合物(图2a),药物通过嵌插结合与DNA 四面体发生相互作用,并被纳米结构靶向带到癌细胞中,发挥药效。Liu等人[9]设计合成了DNA 四面体结构,并且连接了能够靶向癌细胞表面酪氨酸激酶的适体sgc8c。DOX 通过嵌插结合与该纳米结构结合,并被携带靶向到达癌细胞。米托蒽醌作为一种抗癌药物,给药后广泛分布,具有很强的全身毒性,特别是严重的心脏毒性,这些副作用限制了它的应用。Bu等人[10]设计合成了连接叶酸的DNA 四面体结构用来装载抗癌药物米托蒽醌,能够靶向白血病细胞,降低对正常细胞的毒副作用。胶质瘤作为最致命的脑瘤之一,由于血脑屏障和血瘤屏障的存在以及药物靶向性不足,其治疗效果较差。Wang等人[11]合成出DNA 四面体载药体系,连接了能够识别肿瘤细胞上血小板衍生生长因子受体β的Gint4.T 适体,构建了适体-DNA 四面体结构。该载药体系能在体内稳定存在,且装载DOX 进入细胞后,对胶质瘤细胞的细胞毒性明显增强。Yang等人[12]将合成的DNA 四面体上连接核定位信号肽(NLS),携带反义寡核苷酸药物(ASOs)到达细胞核,提高细胞毒性作用。

Ma等人[13]构建了DNA 二十面体(图2b),它由连接端粒酶引物和端粒重复序列的两个锥体DNA 笼组成,药物被包裹在DNA 纳米结构的空腔中。由于癌细胞表面表达异常的端粒酶,因此该纳米结构可以靶向到达病变部位,通过释放铂纳米颗粒到顺铂耐药的肿瘤细胞中,提高药效,克服肿瘤细胞的多药耐药性。除此之外,DNA 三棱柱、DNA 八面体等多面体结构也被构建出,这为癌症的治疗提供了新思路。

图2 通过自组装形成的纳米结构载药示意图(a)DNA 四面体[8];(b)DNA 二十面体[13]

1.2 DNA长双链纳米结构

DNA 长双链纳米结构可通过杂交链式反应(HCR)[14]形成,并且传统抗癌药物如蒽环类药物能够结合在其双螺旋结构上,因此可将其作为药物载体。

由于蒽环类药物能诱导癌细胞产生多药耐药性,从而降低对癌症的治疗效果。Tan 课题组[15]基于HCR 反应构建出连接适体sgc8的DNA 纳米“火车”(靶向癌细胞的适体为“车头”,HCR 反应形成的DNA纳米链为“车厢”),装载DOX 靶向到达癌细胞,有效克服多药耐药性。因此,DNA 纳米“火车”作为药物载体,在运载抗癌药物、克服多药耐药、提高肿瘤治疗效果方面发挥了独特优势。本课题组[16]通过HCR 反应将靶向癌细胞核仁素的AS1411适体连接到DNA 纳米结构上得到适体DNA 纳米“火车”(AS1411NTrs),并以此作为蒽环类药物DOX、表阿霉素(EPI)及柔红霉素(DAU)的载体(图3),通过热力学、释放动力学及细胞毒性实验证明AS1411NTrs运载蒽环类药物,载药量高,能够靶向到达癌细胞(He La细胞),提高药效,对靶细胞有较强的细胞毒性作用,且能减少对正常细胞(L02 细胞)的毒副作用。还使用合成的AS1411NTrs运载化疗药物DOX 与光敏剂亚甲基蓝(TBO),将化疗与光疗联用,克服癌细胞的多药耐药性[17]。由于乳腺癌细胞能够规避DOX 等传统化疗药物的杀伤作用,因此Xu等人[18]利用HCR 反应设计了一种适体偶联的DNA 纳米“火车”,这种高度有序的DNA 双链具有大量装载DOX 和AKT 抑制肽(AKTin)的位点。将DNA 与AKTin偶联,利用引入靶向适体的DNA 纳米“火车”进行药物递送。AKTin通过AKT 信号通路逆转了乳腺癌细胞的多药耐药性,与DOX 具有协同作用,在体内和体外均具有明显的治疗作用,极大地提高了疗效。为了增强药物与癌细胞的结合亲和力,并提高细胞内化,Li等人[19]以HCR 反应形成的双链DNA 为骨架(躯干),将特异性核酸适配体Zy1(腿)连接在骨架上,发展了一种骨架长度可控、配体价数可调的多价结合模式,命名为DNA 纳米“蜈蚣”。纳米“蜈蚣”的躯干用来装载药物DOX,具有较高的载药能力;腿可以牢固和选择性地抓住目标细胞,靶向给药,这种设计不仅提高了对癌细胞的杀伤能力,还降低了对正常细胞的毒副作用,该多价DNA 纳米载体将为构建新型诊疗平台提供有效思路。

图3 用于药物装载的DNA 纳米火车的自组装[16]

1.3 DNA树状大分子和DNA水凝胶

DNA 树状大分子与DNA 水凝胶是通过模块自组装设计形成的复杂DNA 纳米结构。它们可以提供众多的对接位点来装载药物或其他功能元素,并且稳定地防御酶降解,增强对肿瘤的靶向功能等。

DNA 水凝胶的制备在很多情况下是不可控制的,它们倾向于生长成体积较大的水凝胶,因此,这在很大程度上限制了它们作为细胞内运输载体的应用,导致无法用于活细胞。此外由于DNA 水凝胶缺乏有效的释放机制,这在很大程度上限制了它们的生物医学应用,因此Li等人[20]设计合成了一种蛋白支架DNA 纳米水凝胶,具有可调节的大小和刺激响应的特性,用于肿瘤细胞的可激活成像和治疗。它还连接了靶向癌细胞的适体MUC1,能够在富含ATP的细胞内环境中通过结构转换选择性地释放药物。Li等人[21]基于自组装的方法设计合成了尺寸可控的DNA 纳米水凝胶,能够更有效地释放药物,应用于靶向和刺激响应的基因治疗。DNA 树状大分子具有独特的稳定性、多孔性和高度支化结构,并且存在大量的双链序列,具有较多的药物结合位点。Taghdisi等人[22]设计了连接适体MUC1和AS1411的DNA 树状大分子纳米结构,可以同时靶向癌细胞膜表面的异常糖基化粘蛋白与核仁素。它通过嵌插结合装载大量的EPI,靶向到达癌细胞,提高了对乳腺癌细胞和结肠癌细胞的杀伤力。Choi等人[23]合成了连接叶酸适体的DNA 树状大分子,携带抗癌药物和成像剂靶向癌细胞,使高效联合诊疗成为可能。

1.4 大型DNA折纸结构

Rothemund[24]率先开创了DNA 折纸技术这一领域,以一条长的单链DNA 为支架,折叠成想要的形状,结构的固定是通过多个“订书钉链”即短的DNA 链的自组装完成的。这种方法能够避免使用多条短链进行合成时产生的化学计量和纯化问题,具有设计和制造简单、可编程性以及完全可寻址等突出优点。通过DNA 折纸技术可以设计合成更为复杂的DNA 纳米结构,提高载药量。

Jiang等人[25]提出了一种基于自组装的、空间可寻址的DNA 纳米结构载药系统(图4),通过嵌插结合将DOX 连接到DNA 折纸结构上形成复合物,这种复合物对正常和耐药的人乳腺癌细胞均有明显的细胞毒性作用。此外紧密堆积的双螺旋结构提供了大量的嵌插结合位点,DOX 的高加载量可以弥补酶降解和药物意外释放对治疗效果的影响,克服肿瘤多药耐药性。DNA 折纸系统的固有特性,如激活非特异性免疫系统而导致炎症、在生理溶液中不稳定、体内寿命短等,成为了研究所要面临的难题。为了克服这些弊端,Palazzolo等人[26]设计了一种长30 nm、宽10 nm 的DNA 折纸结构,安装在尺寸约为150 nm 的隐形脂质体(LSTDO)内,用来远程装载DOX。因为LSTDO 具有高度的稳定性和良好的生物相容性,所以能够降低免疫系统的识别,提高DOX 的生物分布和抗肿瘤效果,并降低DOX 的骨髓毒性。较小尺寸的DNA 折纸结构具有内吞功能,很容易内化到癌细胞中,而对于大尺寸结构的摄取,可能需要蛋白质通道进入细胞。Li等人[27]设计的矩形DNA 折纸结构,不但空间小,而且成本便宜,并且装载药物能有效地穿过卵巢癌细胞,但是热力学稳定性有待进一步提高。研究人员还通过DNA 折纸技术设计出了三维立体容器、纳米管等更为复杂的结构[28],例如DNA 纳米管的中空心结构可以用来构建仿生膜通道,能够作为多酶生物反应器包裹蛋白质,或者选择性地将药物运送到特定的靶细胞并发挥其活性。这些复杂的DNA 纳米结构的构建,为药物的递送提供了更多有效的方法。

图4 通过DNA 折纸技术设计的DNA 纳米结构[25]

DNA 折纸由于结构设计复杂、支架供应有限、需要数百个“订书针”,因此耗时长、成本高,这些限制了它的大规模生产,并且阻碍了它们在生物医学方面的探索,例如选择性地输送成像剂和治疗剂等。

研究人员将DNA 折纸技术与其他方法联用,可以更为简便地合成DNA 纳米结构。Chen等人[29]通过滚环扩增(RCA)方法得到产物ssDNA,将其作为支架,并结合DNA 折纸技术构建了DNA 纳米带。这种改良之后的方法,使折叠短链的数量从数百条大幅减少到几条,这使得DNA 纳米带的制备具有可扩展性和较低的成本效益。基于RCA 的酶反应合成的支架和主链,允许通过“一锅法”合成DNA 纳米带,进一步降低了成本。由于其独特的周期性和刚性,DNA 纳米带可以有效地内化到细胞内,成为潜在的显像剂和治疗药物的纳米载体。Ouyang等人[30]利用RCA 方法结合DNA 折纸技术设计出可调节长度的DNA 纳米带,用于递送Cp G 免疫刺激药物。Kim 等人[31]设计的仿生DNA 纳米球,连接靶向癌细胞表面过表达的CD44的适体透明质酸,携带反义寡核苷酸药物进入癌细胞。研究人员还设计出DNA 纳米花、DNA 纳米笼等DNA纳米结构作为药物载体提高载药能力。

2 动态DNA纳米结构

与静态DNA 纳米结构相比,动态DNA 纳米结构是指具有一定动态行为的智能纳米结构。动态结构能够对特定的刺激做出响应行为,更灵活地控释药物,降低药物的毒副作用,并提高治疗效果。

从静态纳米结构到动态纳米结构的发展为该项技术的应用开辟了新的途径。动态DNA 纳米结构的主要驱动因素为化学或物理触发器,以此来引起构象的变化。DNA 纳米机器人是出现较早的动态结构,即具有机器人功能的DNA 纳米盒子,能够携带药物,控制其释放,具有分子传感、逻辑计算和可控激活的功能。Li等人[32]利用DNA 折纸技术设计了一种DNA 纳米机器人。平面的DNA 纳米结构上连接了众多凝血酶,并使用含有适体AS1411的固定链将其折叠固定成桶状结构。当到达靶细胞时,核仁素靶向适体作为打开DNA 纳米机器人的分子触发器,使凝血酶暴露出来,激活肿瘤部位的凝血。Andersen等人[33]将DNA 折纸方法扩展到三维,创建出DNA 纳米盒子,用锁-钥匙系统对盒子进行功能化处理,利用外源DNA 作为钥匙,控制释放药物。Douglas等人[34]创建了一个尺寸为35 nm×35 nm×45 nm 的六角形桶状DNA 纳米机器人,当一端的两个适体识别出它们的目标时,锁定的双链解离,释放出抗原,与癌细胞表面受体结合抑制其生长。若DNA 纳米机器人上连接不同的分子触发器,就可以同时响应多个外部信号。DNA 纳米镊子是一种能够连续切换成两种状态的分子机器,包括镊子打开和关闭两种形态。它能够执行捕获、保持和释放目标分子这三个动作。Zhou等人[35]设计了一种镊子状的DNA 纳米机器(图5),两个DNA 双螺旋结构通Holliday连接体连接,中间安装一个DNA 马达,在链置换反应的驱动下,结构在茎-环和双螺旋结构之间循环,镊子打开,药物被释放出来。此外结合适体的DNA 镊子还可以同时检测不同的DNA 靶点、生物分子等。

图5 DNA 纳米机器人的自组装[35]

随着研究的不断深入,各种各样的动态DNA 纳米结构被设计出,并对环境刺激显示出良好的逻辑反应。DNA 纳米开关是一种在外部刺激下,能够在几种构型之间进行可逆异构化的结构,可将其装在纳米结构上,以实现药物控制释放。DNA 步行器能够进行定向的药物运输,是一种很有前途的药物传递平台。它可以在特定的轨道上行走,由步行器、轨道、燃料分子三部分组成,类似于纳米尺寸的微型机器人。可以应用于核酸检测、蛋白质检测、细胞成像和分析。为了克服传统给药系统的低效力,DNA 马达被设计出,通过催化DNA 杂交来完成复杂和程序化的任务。它能够对局部刺激做出反应并相互传递控制信号,推动了分布式药物制造和释放反应系统的开发。动态DNA纳米结构的产生,极大推动了基于DNA 纳米结构的纳米载药体系以及用于体内诊断和药物控释的智能传感器的产生与发展。

3 药物的控制释放

相对于传统给药方式,DNA 纳米结构通常利用对p H、温度、光、生物分子等的响应来实现对药物的控制释放。

富含胞嘧啶(C)的序列可以折叠成i-motif结构,并随p H 的变化而变化,在高p H 时为折叠状态,p H＝5.5时为完全展开状态。利用这一特性,Xu等人[36]设计了质子驱动的富含端粒胞嘧啶的发夹DNA,用于药物的结合和释放,其中DNA 既作为药物载体又作为控制药物释放的装置,得到了由p H 控制的可逆结合和释放的DNA 药物载体。碱性条件下,存在DNA 双螺旋结构,抗癌药物DOX 与其结合。酸性条件下,i-motif结构形成,双螺旋结构被破坏,药物被释放出来。Keum 等人[37]在DNA 四面体中引入i-motif结构,通过p H 调节四面体的组装和解组装,来控制药物释放。为进一步提高DNA 纳米结构的载药量,研究人员引入了纳米金粒子,由于它毒性低,且表面能够连接不同的有机体及配体,被应用于癌症治疗。Alexander等人[38]使用连接了叶酸、温度响应型聚合物的多条DNA 双链,将其结合在纳米金粒子表面,提高了对DOX的载药量。连接的温度响应型聚合物,可根据温度的变化在肿瘤部位释放药物,使药物疗效更为显著。因此,DNA 包裹的纳米金粒子也成为了癌症化疗中有潜力的药物递送载体。

光响应控释药物是一种通过光使DNA 发生解链[39]、断裂[40]等行为来实现药物释放的方法。它通常是在DNA 结构中加入光敏性物质,其中偶氮苯使用居多。研究人员将光响应与p H 响应相结合,设计合成出一种新型光驱动栅状的介孔硅纳米颗粒(MSN)输送系统[41]。这种新型的结构包括孔雀石绿碳醇碱(MGCB)和i-motif结构。MGCB作为光诱导的氢氧化物离子发射器,在光照射后可产生OH－,改变环境p H,从而来改变i-motif结构,控制药物释放。生物分子响应控制药物释放,目前经常使用的是三磷酸腺苷(ATP)。将适体与DNA 纳米结构结合来装载药物,当存在ATP时,其与适体结合,造成原结构的破坏,从而将药物释放出来[42]。在几种控制药物释放的方法中,光响应控制是最简单的。

4 DNA纳米结构的安全性

随着DNA 纳米结构逐渐被广泛应用于药物加载,其安全性也成为首要关注的问题。研究人员从细胞、动物等水平对其安全性进行了研究。与其他无机纳米材料不同的是,DNA 纳米结构的安全性与其尺寸大小没有相关性。Schüller等人[43]证明与脂质体相比,DNA 载体显示没有可检测到的毒性,也不影响脾细胞的活性,是一种高效无毒的胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(Cp G)寡核苷酸递送系统。同时,也表明DNA 折纸结构在暴露于各种细胞系的细胞裂解物当中时能够保持其结构的完整性,并表现出较高的稳定性。动物水平的实验证明DNA 纳米结构毒性低,易于代谢和排泄,但结构不同,在体内的吸收和分布也不相同。所以,通过大量研究证实,DNA 纳米结构细胞毒性较低、安全性较高,是一种安全高效的药物载体。

5 DNA纳米结构载药面临的挑战和未来展望

5.1 DNA纳米结构面临的挑战

DNA 纳米结构在载药方面具有广阔的应用前景,由于其与无机纳米材料相比更高效、安全,所以被广泛用作药物载体。虽然众多实验证明了DNA 纳米结构作为药物载体的安全性,但是它仍有可能引起机体的免疫反应。已有实验通过改变DNA 序列以及对短链DNA 进行修饰等方法降低其免疫原性,因此对它可能引起的免疫反应及解决方法我们仍需进一步的探究。除此之外,虽然DNA 纳米结构在室温下是稳定的,但是它进入人体之后会面临酶降解、蛋白质吸收和调节等挑战,这影响了它的释药速率以及代谢时间。为了解决这一问题,Perrault等人[44]使用聚乙二醇化脂质双分子层包膜DNA 纳米结构,这种方法改善了对核酸酶消化的保护,并且降低了该结构的免疫激活能力。Ponnuswamy等人[45]将DNA 纳米结构表面覆盖低聚赖氨酸涂层,用来防止生理盐水浓度和核酸酶介导的降解而导致的变性。

DNA 纳米结构虽然在载药方面的优势显著,然而作为纳米结构的新成员,仍需要大量的关键信息来支持这种方法的临床应用,目前还未有获批的上市结构。这是因为在它们的实际应用中还需考虑DNA 纳米结构在细胞中的途径和去向,内吞作用机制,以及不同的结构对其在细胞中行为的影响等。它们进入细胞之后的半衰期以及可能引发的其他副反应仍需要进一步的研究。除了生物学方面面临的挑战,DNA 纳米结构的高成本以及如何进行大规模生产也成为制约其发展的一大问题[46]。

5.2 DNA纳米结构的未来展望

虽然DNA 纳米结构是一种具有潜力的药物载体,但是仍有多方面原因限制了它的临床应用。对于未来的研究方向,除了已有使用脂质体或屏蔽载体来包裹DNA 纳米结构,提高其体内稳定性的方法,还应开发出更简便、高效的保护方法。或者从DNA 纳米结构本身出发,对序列进行改变或修饰,来推进DNA 纳米结构载药的实际应用。DNA 的规模化生产可以使用高通量DNA 合成技术,以此来扩大生产,降低成本,满足临床需要。同时还需要对DNA 纳米结构的药效学和药代动力学做进一步的研究,这对其临床应用至关重要。除此之外,DNA 纳米结构载药进入人体之后会面临一系列的生物屏障,克服其引起的免疫反应也是需要解决的一大问题。对于DNA 纳米结构的载药释放,目前居多的为单刺激响应,但是在复杂的生理环境中,单一刺激可能会限制药物的释放,因此多响应控制释药显得尤为重要。虽然DNA 纳米结构载药量多,但是合成复杂、费用高,而且结构不同,在体内吸收和分布也不同,因此需要进一步研究DNA 纳米结构与载药量的关系,提高合成率并明确DNA 纳米结构在生物体中的去向,以更好地发挥其载药能力和靶向释药能力。目前有很多研究表明DNA 纳米结构能够与抗癌药物结合,并在体内外发挥较好的抗肿瘤效果,但关于DNA 纳米结构与药物的相互作用的研究却很少。研究DNA 纳米结构与药物的相互作用能够影响抗癌药物在体内外的吸收、分布、代谢和排泄(ADME),对进一步了解DNA 纳米结构加载抗癌药物发挥疗效的机理有重要意义。此外,目前文献中DNA 纳米结构加载的小分子化疗药物多为蒽环类药物如DOX,对其他化疗药物如紫杉醇类、色霉素类和嘧啶类药物的研究较少。尽管在很多方面仍需进一步探索,但是DNA 纳米结构增加药物的细胞摄取率,提高了药物的药效,并降低药物的毒副作用,有望成为最有应用前景的药物递送载体。